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1、AMAMFSJp0015 维生素 A 高效液相色谱法 定量AM-AM-FS-Jp-0015AM-AM-FS-Jp-0015 维生素维生素 A A 的高效液相色谱法定量测定的高效液相色谱法定量测定1.1.适用范围适用范围 本方法几乎适用于所有的食品中维生素 A 的测定。 2.2.主要试剂和仪器主要试剂和仪器 2.1.主要试剂 无醛乙醇：在 1L 乙醇中加入 5mL50%的 KOH 溶液及 5gZn 粉进行 2h 的回流 后蒸馏之。除去初馏液和后馏液各 10%； 无水 Na2SO4：将无水 Na2SO4在 120的温度下加热 2h 后，在干燥器中放冷、 保存； 维生素 A 醇：维生素 A 乙酸酯碱
2、化后可得维生素 A 醇。计算出其国际单位 IU（或 g），用时进行调制； 维生素 A 醇标准溶液：用异丙醇制备浓度为 5IU/mL、25IU/mL、50 IU/mL 的维生素 A 醇溶液。用时进行调制。 2.2.仪器 碱化用 150mL 褐色烧瓶； 分液漏斗：(250300)mL, 褐色； 蒸馏用烧瓶：250mL，褐色，梨型； 高效液相色谱仪：带有荧光检测器。 3.3.过程简述过程简述 3.1.试验溶液的调制 准确称取 (2030)IU(69g) 维生素 A 于碱化烧瓶中，加入 30mL 的乙 醇和 1mL 的 10%的邻苯三酚乙醇溶液，充分搅拌后，加入 3mL90%（W/V?）KOH 溶液，
3、连接好回馏冷却器，在沸腾的水浴中进行 30min 碱化。快速冷却至室温 后，加入 30mL 的水，移置于褐色的分液漏斗中。将烧瓶依次用 10mL 水、30mL 石油醚清洗，洗液移置于褐色的分液漏斗中，充分振荡、摇匀、放置后，将水 层移置于另一褐色的分液漏斗中，依次用 30mL 石油醚萃取 2 次，合并萃取液， 用 10mL 的水清洗一次，再依次用 50mL 水清洗 3 次，进一步每次用 50mL 水清洗 至酚酞指示液无色为止。 将分液漏斗中的石油醚层加无水 Na2SO4进行脱水后，移至褐色烧瓶中，进 一步每次用 10mL 石油醚清洗残留的 Na2SO4两次，洗液移至烧瓶中。将石油醚醚 萃液在（
4、4045）条件下进行减压蒸馏，其残留物中加入异丙醇溶解，取 1mL（VmL）作为试验溶液。 3.2.高效液相色谱条件： 色谱柱：ODS(4.6mmi.d250mm) 移动相：乙醇:水（95:5） 流 速：0.5mL/min 检测器：荧光检测器（激发波长 340nm，发射波长 460nm） 3.3.定量：将 20L（L）的试验溶液注入色谱柱中，取维生素 A 醇的峰高。3.4.作工作曲线：在同样的色谱条件下，分别取 5IU/mL, 25IU/mL, 50IU/mL 的 维生素 A 醇 标准溶液 20L，注入色谱柱中，以各浓度所对应的峰高作工作曲线。 4.4.结果计算结果计算 通过工作曲线求出 L
5、中维生素 A 醇的 IU 单位数（或 g）SIU(g) , 利用下式计算 100g 试料中维生素 A 的 IU 单位数（或 g）。 试料为油脂的情况下： 100g 试料中维生素 A 的量IU(g) = SIU(g) V(mL) 1000/(L) 100/试料取样量（g） 将油脂从试料中提取出的情况下： 100g 试料中维生素 A 的量IU(g) = SIU(g) V(mL) 1000/(L) 100/试料取样量（g） X/100 X：试料中油脂的百分数 5.5.来源来源：卫生试验法注解2000 版 日本药学会编AMAMFSJp0017 维生素 D 高效液相色谱法 定量AM-AM-FS-Jp-0
6、017AM-AM-FS-Jp-0017 维生素维生素 D D 的高效液相色谱法定量测定的高效液相色谱法定量测定1.1.适用范围适用范围 本方法适用于鱼贝类、兽鸟鲸肉类、蛋类、乳类、蘑菇类食品中维生素 D 的测定。 2.2.主要试剂和仪器主要试剂和仪器 2.1.主要试剂 维生素 D 标准溶液：将结晶的麦角钙化醇（维生素 D2）或胆钙化（甾）醇 （维生素 D3）溶解于无醛乙醇中。先将该标准品的乙醇溶液在 230nm 和 265nm 分别测其吸光度，使 A230/A265在 0.65 以下。标准溶液的准确浓度值由下式求出：维生素 D 标准溶液的浓度（g/ mL）= A265（M/）1000其中 M：
7、维生素 D 标准品的分子量：D2 396.66D3 384.65 ：265nm 的摩尔吸光系数：D2 19200D3 18800 无醛乙醇： 在 1L 乙醇中加入 50%的 KOH 5mL、锌粉 5g，进行约 2 小时的回馏，除去 初馏液和后馏液各 10%左右。 2.2.仪器 离心管：50mL 褐色具塞离心管 烧瓶：50mL 褐色具塞烧瓶高效液相色谱仪：两台带有紫外检测器的高效液相色谱仪，一台用于第一阶 段，另一台用于第二阶段 馏分收集器 3.3.过程简述过程简述 3.1.试验溶液的调制 将试样的可食部切成细丝，混合，取其（50200）g 用快速粉碎机充分粉 碎均匀后，准确地称取（23）g 于
8、离心管中。另一离心管中加入含标准维生 素 D 约 0.25g（Sg）的维生素 D 标准溶液，和试料进行同样的操作。在上 述离心管中加入 1%邻苯三酚乙醇溶液 10mL，60%的 KOH 溶液(25)mL,在 70 水浴中进行 60min 的碱化。加入 1%NaCl 溶液 19mL 和醋酸乙酯:正己烷（1:9） 15ml，盖上塞充分振荡混匀后，进行离心1300g(约 3000rpm)，10min,上层 的醋酸乙酯正己烷分离到梨型烧瓶中。水层进一步用醋酸乙酯:正己烷（1:9） 15ml 萃取 2 次。合并萃取液，在 35下减压蒸馏。残留物用 500L 乙腈:甲醇 （9:1）溶解，作为维生素 D 提
9、取试验溶液。 3.2.第一阶段高效液相色谱 色谱柱：ODS(8.0mmi.d. 300mm) 移动相：乙腈:甲醇（9:1） 流速：1.5mL/min 检出器：紫外检测器（265nm） 维生素 D 提取：用馏分收集器收集标准维生素 D 的保留时间的前后各 45 秒之间 的馏分（事先将维生素 D 标准溶液注入高效液相色谱柱中，确认维生素 D 的出 峰时间）。 3.3.阶段高效液相色谱 色谱柱：硅胶(4.6mmi.d. 250mm) 移动相：正己烷:异丙醇（99.5:0.5） 流 速：1.5mL/min 检出器：紫外检测器（265nm） 定量：将 150L 维生素 D 提取用溶液注入到连有馏分收集器
10、的第一阶段高 效液相色谱柱中，收集维生素 D 部分。把这部分在 35下减压蒸馏，残留物用 正己烷:异丙醇（99.5:0.5）200L 溶解。其中 100L 注入第二阶段高效液相 色谱柱中，量取标准维生素 D(Pstmm)和试料中的维生素 D(Pmm)峰高。 4.4.结果计算结果计算 用下式计算试料中维生素 D 的量。 100g 试料中维生素 D 的量（g）=S(P/Pst) (100/试料量（g）) S标准维生素 D 的量（g） P试料中的维生素 D 的峰高(mm) Pst标准维生素 D 的峰高（mm） 5.5.来源来源： 卫生试验法注解2000 版 日本药学会编AMAMFSJp0018 维生
11、素 E 高效液相色谱法 定量AM-AM-FS-Jp-0018AM-AM-FS-Jp-0018 维生素维生素 E E 的高效液相色谱法的定量测定的高效液相色谱法的定量测定1.1.适用范围适用范围 本方法几乎适用于所有的食品中维生素 E 的测定。 2.2.原理概要原理概要 3.3.主要试剂和仪器主要试剂和仪器 3.1.主要试剂 无醛乙醇：参照维生素 A 的测定中的该项； 正己烷：光谱分析用； 无水 Na2SO4：将无水 Na2SO4在 120的温度下加热 2h 后，在干燥器中放冷、 密封保存； -，-，-，-生育酚（维生素 E）：d-，d-，d-，d- 生育酚（维生素 E）纯品； 母育酚：母育酚纯
12、品； 生育酚同系物标准溶液：生育酚同系物（-，-，-，-生育酚）分 别各准确称取 100mg，分别以正己烷溶解后，定容 100mL。分别各取其 5.0mL 用 正己烷定容 25.0mL，装入褐色具塞瓶中，用氮气排除其中的空气，密封，保存 于冷暗处（可使用一个月）； 母育酚标准溶液：准确称取母育酚约 100mg，加正己烷溶解并定容 100mL。 取其 5.0mL 用正己烷定容 25.0mL，装入褐色具塞瓶中，用氮气排除其中的空气， 密封，保存于冷暗处（可使用一个月）。 3.仪器 化用的烧瓶等容器：参照维生素 A 的测定中的该项。 效液相色谱仪：带有荧光检测器。 4.4.过程简述过程简述 4.1.
13、试验溶液的调制 称取约含生育酚 0.2mg 的试料于碱化烧瓶中，加入 30mL 乙醇及 10%的邻苯 三酚乙醇溶液 1mL，再加入 90%（w/v）KOH 溶液 3mL，连接回馏冷却器，在沸腾 水浴中加热碱化 30min。碱化后，快速冷却到室温后，加 30mL 水，将其移至褐 色分液漏斗中，分别用 10mL 水和 30mL 石油醚清洗碱化烧瓶，将洗液合并到分 液漏斗中，振荡萃取，提取石油醚层。水层进一步用石油醚 30mL 萃取 2 次，合 并石油醚层液，依次用 10mL 水洗一次，再每次用 50mL 水洗三次，进一步用 50mL 水洗至酚酞指示液无色为止。在分液漏斗中分离掉水层后，提取石油醚层
14、， 加无水 Na2SO4脱水，将石油醚层移至褐色烧瓶中。剩余的 Na2SO4每次用 10mL 石油醚清洗 2 次，将洗液并入烧瓶中。将石油醚萃取液在水泵减压下（40-45） 下振动的同时进行蒸馏，残留物用 1.0mL 正己烷溶解，作为试验溶液。 4.2.高效液相色谱条件 色谱柱：正项色谱柱(4.6mmi.d. 250mm) 移动相：正己烷:异丙醇（98:2） 流 速：0.5mL/min 检出器：荧光检测器（激发 298nm，发射 325nm） 4.3.定量： 在试验溶液 1.0mL 中加入母育酚标准溶液 1.0mL（Sg/mL）,取其 10 L 注入高效液相色谱柱中分离测定，求出生育酚同系物的
15、峰高（B-）和母 育酚的峰高（C）。4.4.换算系数 分别取生育酚各同系物标准溶液 1.0mL，加入 1.0mL 母育酚标准溶液，取 其 10L 注入高效液相色谱柱中按照前述液相色谱条件进行操作，求出生育酚 同系物的峰高和母育酚的峰高，再从 10L 中这些物质的重量（g）求出生育 酚同系物对母育酚的换算系数（重量比/峰高比）f-. 5.5.结果计算结果计算 用下式计算 100g 试料中生育酚同系物的量（g）。 试料为油脂将其作为试料的情况下，100g 试料中生育酚同系物的量（g） =S（g）(B-/C) f-. (100/试料量（g）) 从试料将油脂提取出后作为试料的情况下，100g 试料中生
16、育酚同系物的量 （g） = S（g）(B-/C) f-. (100/试料量（g）) （X/100） X试料中油脂含量的百分数。 6.6.来源来源 卫生试验法注解2000 版 日本药学会编AMAMFSJp0024 维生素 C 高效液相色谱法 定量 AM-AM-FS-Jp-0024AM-AM-FS-Jp-0024 维生素维生素 C C 的高效液相色谱法定量测定（含异抗坏血酸添加剂的试料）的高效液相色谱法定量测定（含异抗坏血酸添加剂的试料）1.1.适用范围适用范围 本方法适用于含异抗坏血酸添加剂的样品 2.2.原理概要原理概要 3.3.主要试剂和仪器主要试剂和仪器 3.1.主要试剂 10%（w/v）的偏磷酸溶液：同 4.2.1.1 中 1）。 0.5%（w/v）的偏磷酸溶液：
