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1、1牛结核牛结核 IgG(TB IgG)酶联免疫分析（酶联免疫分析（ELISAELISA）试剂盒使用说明书试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于检测牛血清，血浆中结核IgG(TB IgG)水平。实验原理：实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中牛结核 IgG(TB IgG)。用纯化 的结核 IgG(TB IgG)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中结核 IgG(TB IgG)相结合， 经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与 HRP 标记的结核 IgG(TB IgG)抗体结合，形成 抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB
2、 在 HRP 酶的催化下 转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度 （OD 值） ，与 CUTOFF 值相比较，从而判定标本中牛结核 IgG(TB IgG)的存在与否。试剂盒组成试剂盒组成：试剂盒组成48 孔配置96 孔配置保存说明书1 份1 份封板膜2 片（48）2 片（96）密封袋1 个1 个酶标包被板1481962-8保存阴性对照0.5ml1 瓶0.5ml1 瓶2-8保存阳性对照0.5ml1 瓶0.5ml1 瓶2-8保存酶标试剂3 ml1 瓶6 ml1 瓶2-8保存样品稀释液3 ml1 瓶6 ml1 瓶2-8保存显色剂 A 液3 ml1 瓶6
3、ml1 瓶2-8保存显色剂 B 液3 ml1 瓶6 ml1 瓶2-8保存终止液3ml1 瓶6ml1 瓶2-8保存浓缩洗涤液（20ml20 倍）1 瓶（20ml30 倍）1 瓶2-8保存样本处理及要求样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固 10-20 分钟，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集 上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择 EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合 10-20 分钟后，离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次 离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离
4、心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心 20 分钟左右（2000-3000 转 /分） 。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用 PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞2浓度达到 100 万/ml 左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存
5、备用。标本融化后仍然保持 2-8的温度。加入一定量的 PBS（PH7.4） ，用手工或匀浆 器将标本匀浆充分。离心 20 分钟左右（2000-3000 转/分） 。仔细收集上清。分装后一份 待检测，其余冷冻备用。 6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上 进行试验，可将标本放于-20保存，但应避免反复冻融. 7. 不能检测含 NaN3 的样品，因 NaN3 抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。操作步骤：操作步骤： 1.编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照 2 孔、阳性对照 2 孔、空白对照 1 孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相
6、同） 2.加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照 50l。然后在待测样品孔先 加样品稀释液 40l，然后再加待测样品 10l。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不 触及孔壁，轻轻晃动混匀， 3.温育：用封板膜封板后置 37温育 30 分钟。 4.配液：将 30（48T 的 20 倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至 600ml 后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此 重复 5 次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂 50l，空白孔除外。 7.温育：操作同 3。 8.洗涤：操作同 5。 9.显色：每孔先加入显色剂 A 50l，再加入显色剂 B
7、 50l，轻轻震荡混匀，37避光显 色 15 分钟 10. 终止：每孔加终止液 50l，终止反应（此时蓝色立转黄色） 。 11. 测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值） 。 测定应在加终 止液后 15 分钟以内进行。结果判定：结果判定：试验有效性：阳性对照孔平均值1.00; 阴性对照平均值0.10临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15阴性判定：样品 OD 值 临界值（CUT OFF）者为结核 IgG(TB IgG)阴性阳性判定：样品 OD 值 临界值（CUT OFF）者为结核 IgG(TB IgG)阳性 注意事项注意事项 1操作严格按照说
8、明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。 2试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未 用完，板条应装入密封袋中保存。 3浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 4 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 5底物请避光保存。 6试验结果判定必须以酶标仪读数为准，使用双波长检测时，参考波长为 630nm 7所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为 2M 的硫酸，使用时必须3注意安全。保存条件及有效期保存条件及有效期 1试剂盒保存：；2-8。 2有效期：6 个月4FOR RESEARCH USE ONLYBovi
9、ne Tuberculosis IgGDrug NamesGeneric Name：Bovine Tuberculosis IgG(TB IgG) ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determination of TB IgG concentrations in Bovine serum, and other biological fluids.Principle of the assayThe kit assay TB IgG level in the sample，use Purified TB IgG antibody to coat m
10、icrotiter plate wells, make solid-phase antigen, then add TB IgG to wells, Combined With TB IgG antibody, after washing and removing non-combinative antibody and other components ,then Combined TB IgG antibody which with HRP labeled become antibodyantigen - enzyme- antibody complex, after washing Co
11、mpletely, Add TMB substrate solution, TMB substrate becomes blue color At HRP enzyme-catalyzed, reaction is terminated by the addition of a sulphuric acid solution and the color change is measured spectrophotometrically at a wavelength of 450 nm. Compared with the CUTOFF value, according to this to
12、judge TB IgG exist in the sample or not.5Materials provided with the kitMaterials provided with the kit48determinations96 determinationsStorageUser manual11 Closure plate membrane22 Sealed bags11 Microelisa stripplate112-8 Negative control0.5ml1 bottle0.5ml1 bottle2-8Positive control0.5ml1 bottle0.5
13、ml1 bottle2-8HRP-Conjugate reagent3ml1 bottle6ml1 bottle2-8Sample diluent3ml1 bottle6ml1 bottle2-8Chromogen Solution A3ml1 bottle6ml1 bottle2-8Chromogen Solution B3ml1 bottle6ml1 bottle2-8Stop Solution3ml1 bottle6ml1 bottle2-8wash solution（20ml20 fold） 1bottle（20ml30 fold） 1bottle2-8Specimen require
14、ments1.serum- coagulation at room temperature 10-20 mins，centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.2.plasma-use suited EDTA or citrate plasma as an anticoagulant,mix 10-20 mins ,centrifugation 20-min at the speed of 2000-3
15、000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.3.Urine-collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again. The Operation of Hydrothorax and cerebrospinal fluid Reference
16、 to it.4.cell culture supernatant-detect secretory components, collect sue a sterile container, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. remove supernatant,detect the composition of cells, Dilut cell suspension with PBS（PH7.2-7.4）, Cell concentration reached 1 million / ml, repeated freeze-thaw cycles, damage cells and release of intracellular components, centrifugation 20-min at the spe
