《抗IBDV+Gt株单克隆抗体制备及抗原表位分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《抗IBDV+Gt株单克隆抗体制备及抗原表位分析（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫抑制病论坛论文集摘V i r u s ，行融合，鉴定。W抗I B D VG t 株单克隆抗体制备及抗原表位分析程宇1 2 ，王笑梅p ，高玉龙1 ，高宏雷1 ，付朝阳1 ，简子健2 ，陆贵丽21 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨1 5 0 0 0 1 ；2 新疆农业大学动物医学院，乌鲁木齐8 3 0 0 5 2要：采用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化的鸡传染性法氏囊病病毒( I n f e c t i o u sB u r s a lD i s e a s eI B D V ) 弱毒G t 株免疫B A L B c 小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，取其脾细
2、胞与S P 2 O 骨髓瘤细胞进经过三次筛选克隆，获得2 株具有分泌抗I B D V7 D 4 、5 D 2 两株杂交瘤细胞系，并对7 D 4 J 朱进行了详细e s t e r n b l o t t i n g 表明，能够特异地与I B D V4 3 k d 蛋白条带反应。杂交瘤细胞上清效价在2 5 1 0 2 ，腹水效价在6 4 1 0 6 ；并运用7 D 4 、5 D 2 介导的相力I E L I S A 进行抗原表位的初步定位，发现这两株单抗针对不同的V P 2 抗原表位。关键词：传染性法氏囊病病毒( I B D V ) ：单克隆抗体( M c A b ) ：抗原表位E s t a
3、b l i s ha n di n d e n t i f i c a f i o no fA n t i g e n i cE p i t o p e st oM o n o c l o n a lA n t i b o d i e sa g a i n s tG ts t r a i no fI n f e c t i o u sB u r s a lD i s e a s eV i r u sC H E N GY u l 2 ，W A N GX i a o m e i l + ，G A OY u l o n 9 1 ，G A OH o n g l e i l ，F UC h a o y
4、a n 9 1 ，J I A d 、IZ i - j i a n 2 ，L UG u i 1 i 1 2( 1 H a r b i nV e t e r i n a r yR e s e a r c hI n s t i t u t eo fC A A S ，H a r b i n1 5 0 0 1 ，C h i n a ；2 C o l l e g eo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e ，X i n gJ i a n gA g r i c u l t u r eU n i v e r s i t y ，U r u m c h i8 3 0 0 5 2c
5、 h i n a )A b s t r a c t ：T h ei n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s ( I B D V ) o fG ts t r a i nw a sp u r i f i e db yd i s c o n t i n u o u sg r a d i e n tu l t r a c e n t r i f u g a t i o n B yu s i n gt h eh y b r i d o m at e c h n i q u ea n dt h r e et i m e sc l o n i n
6、 g ，7 D 4a n d5 D 2h y b r i d o m ae e l l Ss e c r e t i n gm o n o c l o n a la n t i b o d y ( M c A b ) w e r ee s t a b l i s h e db yt h ef u s i o no fm o u s em y e l o m ac e l l SS P 2 Oa n ds p l e e nc e l l sf r o mB A L B cm i c ei m m u n i z e dw i t hp u r i f i e dI B D V W e s t
7、e r n b l o t t i n gi n d i c a t e dt h a tM c A bh a ss p e c i a lr e a c t i o nw i t ht h ep r o t e i nw h i c hs t r i pi S4 3 k d T h ea n t i b o d yt i t e r so f7 D 4w a s2 5 1 0 2i nc u l t u r es u p e r n a t a n t sa n d6 4 1 0 。i na s c e t i cf l u i d s W i t h s a n d w i c hE L
8、I S At h er e s u l to ft h ea n t i g e ne p i t o p e st h a tt h et w oo f7 D 4a n d5 D 2M c A b sw e r eo nd i f f e r e n t l o c a t i o n st oV P 2w e r eb a s i Sl o c a t e d K e yw o r d s ：I n f e c t i o u sb u r s a ld i s e a s ev i r u s ( I B D V ) ，M o n o c l o n a l a n t i b o d
9、y ( M c A b ) ，A n t i g e ne p i t o p e s传染性法氏囊病病毒( I B D V ) 属于B i r n a v i r i d a e 科，A v i b i r n av i r u s 属。I B D V 从血清学上分为I 型和I I型，但只有I 型能引起感染的鸡发生病理性反应。I B D V 通过破坏前B 细胞而引起2 周3 周龄的鸡发生免疫抑制，并可诱发多种疾病或使多种疫苗免疫失败u4 。I B D 虽不是一种新病，但它不断出现的新变化使研究者们对它倍加关注；它持续地造成养鸡业的严重经济损失，也使研究者们和所有相关人员增加了彻底控制它的强烈愿
10、望。而单克隆抗体因其具有专一的特异性，性质稳定，一经制备可长时间获得旧3 ，目前用利单克隆抗体应用于I B D V 的检测也有报道，本实验利用杂交瘤技术，制备法氏囊病毒蛋白特异性单克隆抗体及对单抗在I B D 抗原上的表位初步分析。本病新的血清型和变异株仍在不断产生，而各血清型之间的交叉保护性较差，使I B D V 的诊断、防治及流行病学调查较为困难，本实验建立了分泌抗I B D V 的单克隆抗体杂交瘤细胞株，不仅为今后发展M c A b 介导的灵敏、特异、快速、简便的I B D V 诊断方法奠定基础，也为I B D V 分子生物学特性研究提供有利的工具。中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫
11、抑制病论坛论文集 。 _ _ 1 材料与方法l 。l 材料1 1 1 病毒I B D VG t 株、G x 株由，本实验室保存、C I A V 、N D V 、R E O V 均由哈兽研生物技术国家重点实验室提供。1 1 2 试验动物与细胞系S P 2 O 骨髓瘤细胞由本实验室保存；S P F 胚、B A L B c 小鼠均购于哈尔滨兽医研究所。1 1 3 主要试剂及仪器：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、P E G ( R W l 5 0 0 ) 购自S i g m a ，9 6 孔聚乙烯板、胎牛血清、H A T 及D M E M 培养基均购自I n v t r i g e n 公司。高速、超速
12、离心机均为B e c k m a n 公司产品。1 1 4引物的设计与合成根据G e n B a n k 已公布的I B D VV P 2 基因序列设计，引物的核苷酸序列为：上游引物( P 1 ) 5 一G G G 从T T C A T G A C G A A C C T G C 从G A T 一3 ，其5 端设计有肪D RI 位点；下游引物( P 2 ) 5 一G c G T C G A c C C G G A T T A T G T C T T T G A A G 一3 ，其5 端设计有S a lI 位点。引物由上海S a n g o n 公司合成并经过H P L C纯化。以P l 和P
13、2 为上、下游引物扩增V P 2 基因全长，理论扩增产物为1 3 5 0 b p 。1 2 方法1 2 1 免疫原制备及鉴定1 2 1 1 病毒提纯将病毒接种于病毒的鸡胚成纤维细胞培养液反复冻融三次后，以80 0 0r p m ，4 离心3 0m i n ，而后取上清液体3 0 0 0 r p m 离心3 h ，弃上清，以T N E ( p H 8 0 ) 缓冲液4 过夜重悬沉淀，经不连续蔗糖密度梯度离心，3 0 0 0 0 r p m 、3 h 后弃上清，取各层悬液以T N E 缓冲液悬浮，4 0 0 0 0 r p m 、3 h 脱糖，后经I B D V 电镜观察，病毒主要分布于3 0 -
14、 4 0 层间，紫外分光光度计测定蛋白含量，作为免疫抗原，- 2 0 保存备用。1 2 1 2 病毒R T P C R 鉴定以Q I A G E N 公司试剂盒说明提取R N A ，随机引物反转录，再以P 1 ，P 2 上下游引物各3 u l ( 1 0 p m o l u L ) ；l O xE x T a qb u f f e r ( 2 5 u L ) ；d N T P ( 2 u L ) ；E x T a qe n z y m e ( 0 5 u L ) ，反转录产物2 u l ，灭菌去离子水补至2 5 u l ，混匀后瞬离。反应条件为：9 5 。C5 m i n ；9 4 3 0 秒
15、，5 5 3 0 秒，7 2 3 0 秒，循环3 0 次；7 2 延伸l O m i n 。反应完毕后取5 u l ，用0 8 琼脂糖凝胶电泳检测，检钡I P C R 产物根据华瞬胶回收试剂盒操作说明回收、测序、并进行比较分析。1 2 。3 分泌抗I B D VG t 株单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立1 2 3 1 免疫将纯化的I B D V 加等量的弗氏完全佐剂临1 ，用注射器乳化，腹腔注射6 8 周龄B A L B c 小鼠，每只l O O uL ( 1 2 m g m L ) ，1 4 d 后用含弗氏不完全佐剂的抗原腹腔二次免疫，1 0 0 u L 只，2 0d 后用I B D V 抗原尾腹腔注射兼静脉免疫1 5 0u L 只，3d 后取脾用于融合。1 2 3 2 检测方法建立按常规间接E L I S A 操作步骤，运用棋盘滴定试验，确定抗原最佳包被浓度、待检抗体最佳工作浓度等，建立了一套间接E L I S A 方法，用于单克隆抗体的筛选。1 2 3 3 阳性杂交瘤细胞株筛选参照文献 2 方法进行。将处于对数生长期的S P 2 O 骨髓瘤细胞与免疫鼠的脾制成细胞悬液以8 ：1 比例进行融合H 1 。待融合孔细胞长至孔底1 3 至1 2 时，通过间接E L I S A 筛选出阳性杂交瘤细胞株，利用有限稀释法连续克隆2 3 次至阳性率1 0
