鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定1 - 副本

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1、鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定鸡蛋清溶菌酶的提取及电泳鉴定一、一、实验目的实验目的 1 了解鸡蛋清溶菌酶的性质、常用制备方法及原理 2 掌握盐析法分离蛋白质原理及操作 3 掌握 SDS-PAGE 鉴定蛋白纯度的原理及操作二、实验原理二、实验原理 盐析法盐析法 1878 年 Hammarster 首次使用，是粗分离蛋白质的重要方法之一。 许多蛋白质在纯水或低盐溶液中溶解度较低，若稍加一些无机盐则溶解度增加，这种 现 象称为“盐溶” （Salting in） 。 而当盐浓度继续增加到某一浓度时，蛋白质又变得不深而自动析出，这种现象称为 “盐 析“（Salting out） 。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶

2、电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法: 常用蛋白质纯度分析及分子量测定技术。 SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium declecyl Sulfate） 破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的共价键，使蛋白质变性而改变原来的 空间构象，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在的条件下，由于蛋白质分子内的二硫键被还 原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与 SDS 结合从而形成带负电荷的 SDS-蛋 白质复合物。 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18，即 1.8nm） ，而长轴则随蛋 白质分子量成正比地变化。这样的 SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋 白质原有电荷和形状的

3、影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。使蛋白质 的电泳迁移率仅仅取决于分子大小这一因素。 当蛋白质的分子量在 11，700165，000 之间时，电泳迁移率与分子量对数呈直线关系， 符合直线方程式：LgMw= bx + k 式中：Mw 为蛋白质分子量，X 为电泳迁移率，k 和 b 均为常数。利用这一关系将已 知分子量的标准蛋白质电泳迁移率与分子量的对数作图即可得到一条标准曲线。只要测得 未知分子量的蛋白质在相同条件下电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳： 以聚丙烯酰胺凝胶作为支持电泳介质。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和 N，N甲叉双 丙烯酰胺聚合而成

4、。在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其孔隙度可 在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之 既有适宜的孔隙度，又有比较好的机械性质。一 般说来，含丙烯酰胺 7-7.5%的凝胶，机 械性能适用于分离分子量范围 1 万至 100 万物质，1 万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺 15- 30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺 4%的凝胶。 连续体系；不连续体系前者指整个电泳系统中所用缓冲液，pH 值和凝胶网孔都是相同的，后者是指在电泳 系统中采用了两种或两种以上的缓 冲液，pH 值和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳 过程中浓缩成层，从而提高分

5、辨能力。最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由 Ornstein (1964) 和 Davis(1964) 设计的, 样品 和浓缩胶中含 Tris-HCl(pH 6.8), 上下槽缓冲液含 Tris-甘氨酸(pH 8.3), 分离胶中含 Tris- HCl(pH 8.8)。系统中所有组分都含有 0.1% 的 SDS(Laemmli, 1970)。 凝胶的筛分特性取决于它的孔径，孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓 度的函数。三、实验步骤三、实验步骤鸡蛋去蛋黄 蛋清均匀搅拌蛋清液蛋清液盐酸调 ph 至 5.5,70处理 15 分钟。热变性沉淀杂蛋白离心，去沉 淀，去除碱 性杂蛋白NaOH 调

6、 ph8.0-8.5， 加饱和硫酸铵，至饱 和度为 10%。较纯的碱性蛋白质 沉淀。冰浴 30min，离心去 上清。较纯的碱性蛋白在 Eppendorf 管中加适量沉淀，用 200ulddH2O 沉淀，溶液加入 20ulTCA， 沉淀蛋白颠倒 3 次，13000rpm 离心 10min取沉淀加 200ul 丙酮，颠倒 三次，13000rpm 离心 10min，洗去 TCA取沉淀丙酮挥发干净，加入适量 loading buffer（增加样品比 重）和 ddH2O，水浴 15min准备电泳3.1 蛋清准备 取 1 枚鲜鸡蛋，洗净擦干，在小头用镊子轻轻捣一直径为 4mm 的小孔，下用烧杯或 量筒接好

7、，再在大头打一细小针孔进气，此时蛋清缓缓自动流出。取蛋清的操作应很细致， 避免蛋黄破裂混入蛋清而影响实验结果。将所得鸡蛋清充分打匀（约 15 分钟） 。打时力戒 过猛以防止产生泡沫变性作用。然后用 4 层纱布滤去杂质，测量体积（或体重） ，记录 pH 值。3.2 热变性 取稀盐酸调节鸡蛋清 pH 值 5.5 左右（4-7） 、70处理 15 分钟。离心，去沉淀，保留 上清。3.3 分步盐析 取适量上清，先用 1N 的氢氧化钠后用 0.1N NaOH 溶液调至 pH 8.08.5，加 60乙醇 溶液至饱和度为 10%。冰浴放置 30min。离心，弃上清。 （比例：800ul 到 eppendor

8、f 管中， 加入 88.9ul 饱和硫酸铵） 。3.4 样品处理 取适量沉淀到干净的 eppendorf 管内，加 200ul ddH2O 溶解沉淀。加入 20ulTCA， 颠 倒三次，13000rpm 离心 10min。弃上清。Eppendorf 管中加入 200ul 丙酮，颠倒三次， 13000rpm 离心 10min。弃上清。待管内残留丙酮挥发干净，加入适量 loading buffer 及 ddH2O，沸水浴处理 15min，待电泳鉴定。3.5 电泳鉴定 上述样品用浓度 12%的 SDS-PAGE 分析。注意加入标准对照3.6 结果观察 染色，脱色，观察实验结果四、四、SDS-聚丙烯酰

9、胺凝胶电泳操作：聚丙烯酰胺凝胶电泳操作： 1 实验材料和试剂 （1）丙烯酰胺和 N, N-亚甲双丙烯酰胺。以温热（利于溶解双丙烯酰胺）的去离 子水配制含有 29%（w/v）丙烯酰胺和 1%（w/v）N, N-亚甲双丙烯酰胺的贮存液， 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反 应是光催化或碱催化的，故应核实溶液的 pH 值不超过 7.0。这一溶液置棕色瓶中 贮 存于室温，每隔几个月须重新配制。 （2）十二烷基硫酸钠（SDS） 。SDS 可用去离子水配成 10%（w/v）贮存液保存于 室温。 （3）用于制备分离胶和积层胶的 Tris 缓冲液。 （4）TEMED(N,

10、N,N,N-四甲基乙二胺)。TEMED 通过催化过硫酸铵形成自由 基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。 （5）过硫酸铵。 过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。 须新鲜配制。 （6）1.5M Tris，pH8.8（分离胶缓冲液） （7）1M Tris，pH6.8（浓缩胶缓冲液） （8）Tris-甘氨酸电泳缓冲液。25mM Tris，250mM 甘氨酸 (pH 8.3)，0.1% SDS， （9）样品处理液，50mM Tris-HCl(pH 6.8)，100mM DTT(or 5% 巯基乙醇)，2% SDS，0.1% 溴酚蓝，10%甘油 （10）染色液：0.1% 考马斯亮蓝 R

11、250，40% 甲醇，10% 冰醋酸 （11）脱色液：10% 甲醇，10% 冰醋酸2 实验步骤 1. 配制 SDS 聚丙烯酰胺凝胶所需的各种试剂 2SDS 聚丙烯酰胺凝胶的灌制 根据厂家说明书安装玻璃板。 确定所需凝胶溶液体积，按下表给出的数值在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度 配制一定体积的分离胶溶液。一旦加入 TEMED，马上开始聚合，故应立即快速 旋动混合物并进入下步操作。 迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的 齿长再加 0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约 23mm 高） ，以阻止氧气 进入凝胶溶液。 分离胶聚合完全后（约 30 分钟） ，倾出覆盖

12、水层，再用滤纸吸净残留水。 制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备一定体积及一定浓度的 丙烯酰胺溶液，一旦加入 TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并 进入下步操作。 聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避 免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室 温下。 在等待浓缩胶聚合时，可对样品进行处理，在样品中按 1:1 体积比加入样品处理 液，在 100加热 3 分钟以使蛋白质变性。 浓缩胶聚合完全后（30 分钟） ，小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上 下槽各加入 Tris-甘氨酸电极缓冲液。必须设法排出凝胶底部

13、两玻璃板之间的气 泡。 按予定顺序加样，加样量通常为 1025l（1.5mm 厚的胶） 。 将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为 8V/cm。当染料前沿进入分离胶后， 把电压提高到 15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部上方约 1cm，然 后关闭电源。 从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝 胶下部切去一角以标注凝胶的方位。 3用考马斯亮蓝对 SDS 聚丙烯酰胺凝胶进行染色经 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白 质样品可用考马斯亮蓝 R250 染色。染色 12 小时或过夜。 4. 换脱色液脱色，需 310 小时，其间更换多次脱色液至背景清楚。 此方法检

14、测灵敏度为 0.21.0 ug。脱色后，可将凝胶浸于水中，长期封装在塑料袋内而不 降低染色强度。为永久性记录，可对凝胶进行拍照，或将凝胶干燥成胶片。五、实验结果与五、实验结果与思考题：思考题：结果分析：实验失败。 原因： 乙醇不能作为盐析沉淀介质 PH 过大，蛋白变性 1 、分析盐析法制备溶菌酶的优缺点及改进方法答：由于溶酶菌比较稳定 ，分子量、等电点等与蛋清中其他蛋白质有较大差异。因此可 以利用常规方法的科学组合分离得到纯度较高、活性较强的溶菌酶。改研究采用调节 ph 和 硫酸铵分段盐析法两步组合，从鸡蛋清中提取溶菌酶，方法简单易行，成本低廉、分离周 期短、溶菌酶纯度高、是一种易于推广和产业化的有效方法。但所制得的溶菌酶过程中易 因为各种原因死亡。 2 、查阅文献，设计溶菌酶结晶的制备方法答：负载染料的主客体复合交联溶菌酶晶体的制备方法。该方法通过简单的溶液浸渍法， 将染料负载在交联溶菌酶晶体的孔道中，客体材料与孔道中的骨架结构之间发生化学作用， 形成受空间限域的纳米粒子，从而固定于复合晶体孔道中。本发明可以通过改变染料溶液 体系与交联溶菌酶晶体的反应条件实现对主客体复合交联溶菌酶晶体孔道中染料的负载量、 光学性能的优良进行有效调控。本发明的方法工艺流程简单、可控性强、产品可重复率高。