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1、抑癌基因砌对胃癌淋巴转移作用的研究曲明阳邢光明冯秉安大连医科大学第二粘床学院( 1 1 6 0 2 3 )擅赛目的研究胃癌淋巴转移的血管内皮生长因子C ( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o rC ，V E G F - C ) 相关机制，探讨抑癌基因n m 2 3 ( n o n em e t a s t a s i sg e n e2 3 )表达对胃癌淋巴转移的影响。方法采用免疫组化S P 法检测6 8 例人胃癌组织中n m 2 3 、V E G F - C 和淋巴管内皮标记物V E G F R - 3 ，计算n
2、m 2 3 、V E G F - C 表达阳性率和肿瘤组织微淋巴管密度( L M V D ) ，并对n m 2 3 、V E G F _ c 蛋白表达与L M V D 及有无淋巴结转移进行相关性分析。结果淋巴结阳性标本V E G F - C 阳性率和淋巴管密度显著高于淋巴结阴性标本组( 7 0 0 5 3 0 0 0 ，p O 0 5 ；3 1 6 0 2 0 2 0 ，p O 0 5 ) ；与V E G F - C 阴性组比较，V E G F C阳性组淋巴管密度明显增高( 2 9 6 0 2 1 4 0 ，p O 0 5 ) 。与淋巴结阴性标本组比较，n m 2 3 - H 1 蛋白表达阳性
3、率在淋巴结转移阳性标本组有显著降低( 2 6 3 2 7 0 0 0 ，p O 0 5 ) 。与n m 2 3 - H l 表达阴性组比较，n m 2 3 - H l 阳性组V E G F - C 表达和L M V D 显著降低( 3 5 4 8 6 7 5 7 ，p O 0 5 ；1 9 6 1 3 1 9 3 ，p O 0 5 ) 。相关分析表明淋巴结转移与V E G F C 和L M V D 呈正相关( B = O 8 7 8 和0 4 0 8 ) ，与n m 2 3 - H l 表达负相关( B =一0 8 9 4 ) ；V E G F C 的表达与L M V D 成显著性相关( B
4、- - - - O 4 5 6 ) ，与n m 2 3 - H l 表达星负相关( B 一0 9 0 7 ) 。结论V E G F - C 的表达与胃癌的淋巴结转移关系密切；V E G F - C 主要通过调节肿瘤组织微淋巴管的生成而影响肿瘤淋巴结转移；n m 2 3 - H 1 蛋白可通过下调V E G F - C 表达、抑制胃癌淋巴管的生成而抑制肿瘤转移。关键词s 胃癌淋巴转移n m 2 3 - H lV E G F _ CL M V D胃癌是最常见的肿瘤，患者主要死于复发和转移，而淋巴转移是其最主要的转移方式。目前肿瘤淋巴转移机制不明。V E G F - - C 是血管内皮生长因子家族的
5、成员，它可与特异受体V E G F R 一3 结合，介导新生淋巴管生长n q I 。n m 2 3 基因于1 9 8 8 年分离鉴定n ，并证实其与肿瘤转移抑制有关。在消化道恶性肿瘤中n m 2 3 表达阴性的肿瘤，癌细胞发生转移的比率明显高于表达阳性者强3 。本研究探讨胃癌n m 2 3 表达与微淋巴管发生及淋巴转移的1 5 5关系，探讨其在胃癌预后中韵价值材辩和方法一、材料1 标本：胡例胃癌组织标本取自大连医科大学附属第二医院普外科2 0 0 2 年2 月一2 0 0 3 年8 月手术患者，年龄3 4 8 7 岁( 平均的岁) ，男性4 5 例，女性2 3 例，术前未经任何治疗，均经临床病
6、理学确诊。其中区域淋巴结阳性者3 8 例，阴性者3 0 例。2 试剂：( 1 ) 兔抗人V E G F - C 抗体、鼠抗人n m 2 3 一H I 抗体和兔抗人V E G F R 一3 抗体均为美国S a n t aC r u z 公司产品。( 2 ) S P 免疫组化试剂盒、D A B 显色系统购自北京中山生物公司。二、方法1 免疫组化：采用s P 法。所有标本经常规石蜡包埋，制备5 1 a m 厚连续切片贴附于涂有1 0 多聚赖氨酸的载玻片上。切片常规脱蜡至水，3 H 。0 ：l O m i n 阻断内源性过氧化物酶，正常家兔血清室温封闭l O m i n ，阻断非特意性反应，n m 2
7、 3 - H l ( 1 ：5 0 ) 、V E G F - C ( 1 ：1 0 0 ) 、V E G F R 一3 ( 1 ：5 0 ) 一抗湿盒中孵育，4 C 过夜，P B S 充分洗涤( 5 m i n X3 次) ，生物素化羊抗兔或鼠二抗3 7 孵育3 0 m i n ，P B S 冲洗( 5 m i n x 3 次) ，辣根酶标记链酶卵白素，3 7孵育4 5 m i n ，P B S 洗涤( 5 m i n 3 次) 。D A B 显色，显微镜下控制显色时间( 约6 m i n ) ，蒸馏水终止显色。苏木素轻度复染( 1 m i n ) 。脱水、透明、中性树脂封片，光镜下观察。P
8、B S 代替一抗作为阴性对照。2 结果判定：( 1 ) n m 2 3 - H 1 和V E G F - C 阳性结果判断：凡在细胞浆染色里棕黄色颗粒或团块者为阳性表达，细胞不着色或呈淡黄色为阴性，4 0 0 光镜下随机选取5 个视野，以定位明确位手胞浆，染色朗显，平均2 0 以上细胞染色的组织切片视为r i m 2 3 一H 1 或V E G F - C 阳性，而染色弱或完全不染色者为n m 2 3 - H 1 或V E G F - C 阴性。( 2 ) 肿瘤组织微淋巴管计数：采用W e i d n e r 阳1 等的方法，先在低倍镜下寻找新生脉管蕞密集的区域即“热点”( h o t s p
9、 o t ) ，然后在高倍镜下观察染成棕色的单个细胞和细胞丛，并以此作为一个脉管。以5 个高倍镜视野脉管的平均数表示脉管数。与抗体起l 锚反应的巨噬细胞和浆细胞在镜下根据形态学予以捧除。3 统计学处理：采用S P S S i O 0 软件进行统计学分析。两个独立样本均数比较采用t 检验；多个样本间的两两比较采用单因素方差分析；多变量间相关性采用l o g i s t i c 回归进行分析。结果1 、n m 2 3 一H l 免疫染色结果：6 8 例胃癌组织中，n m 2 3 一H 1 蛋白染色阳性者3 l 例，阴性者3 7 例，阳性率为4 6 5 9，n m 2 3 - H 1 阳性物质位于细
10、胞浆内，为棕黄色颗粒或者团块( 图卜3 ) 。2 V E G F - C 免疫染色结果：6 8 例胃癌组织中，V E G F - C 染色阳性者3 6 例，阴性者3 2 例，阳性率为5 2 9 4 ，V E G F - C阳性物质位于细胞浆内，为棕黄色颗粒( 图4 6 ) 。3 微脉管染色结果：在胃癌组织的边缘及癌周可见V E G F R - 3 阳性微淋巴管，呈棕褐色，多为条索状( 图7 9 ) 。4 n m 2 3 - H l 、V E G F - C 表达与胃癌微淋巴管密度( L M V D ) 及淋巴结转移之间关系：由下表可见，V E G F - C 阳性率在淋巴结转移阳性标本组高于淋
11、巴结阴性组n m 2 3 - H 1 表达 +V E G F - C 表达+淋巴结转移3 l1 9 6 1 1 8 93 73 1 9 3 2 3 l3 62 9 6 0 士2 9 7 1 12 53 22 1 1 0 2 0 72 01 2上一92 26 5 92 61 1+3 83 1 6 0 + 2 0 7 。1 02 82 71 12 6 3 27 1 0 5 43 02 0 2 0 2 7 72 I992 I7 0 0 03 0 0 0木与v E G F _ c 表达阴性组比较P 0 0 5 ，# 与淋巴结转移阴性组比较P 0 0 5 。( 2 7 3 8 ：7 1 0 5 ，9 3
12、 0 ：3 0 0 0 ，P 0 0 5 ) ；V E G F - C 阳性组淋巴管密度明显高于V E G F C阴性组( 2 9 6 0 2 1 4 0 ，P 0 0 5 ) ；淋巴管密度在淋巴结转移阳性组较淋巴结阴性组有显著提高，分别为3 1 6 0 和2 0 2 0 ；与n m 2 3 - H 1 阴性组比较，n m 2 3 - H 1 表达阳性组V E G F C表达阳性率显著降低( 9 3 1 ) ，淋巴管密度同时下降( 1 9 6 1 ) 。淋巴结转移阳性组n m 2 3 一H 11 5 7阳性率明显低于n m 2 3 - H 1 阴性组( 2 6 3 2 7 0 0 0 ) 4
13、相关性分析：相关分析表明，人胃癌淋巴结转移与癌周L M V D 和V E G F - C 的表达成正相关( B = 0 4 0 8和0 8 7 8 P 0 0 5 ) ，与m n 2 3 - H 1 表达负相关( B - - - O 8 9 4 P 0 0 1 ) V E G F - C 的表达与L M V D 成显著性相关( B = O 4 5 6 ，P 0 0 5 ) ，与n m 2 3 - H 1 表达呈负相关( B ：- O 9 0 7 P 0 0 1 ) 讨论V E G F - C 作为V E G F 家庭成员，是特异性的淋巴管生长因子。目前认为，V E G F - C 与V E G
14、 F R - 3 结合，促进淋巴内皮细胞增殖和淋巴管增生，而且新生成的淋巴管可能直接引起肿瘤细胞的转移和扩散。研究表明V E G F - C 与淋巴管生成特异相关，促进肿瘤淋巴结转移n 1 。V E G F - C 可能通过V E G F R - 3 发挥淋巴生成调节作用m 1 。临床研究发现，胃癌最常见并且较早期发生淋巴转移。胃癌基质中常可见新生和扩大的淋巴管，肿瘤细胞侵入的淋巴管多为癌周的毛细淋巴管，这些淋巴管缺乏完整的基膜，内皮细胞连接疏松，因此有利于瘤细胞进入。但迄今为止，肿瘤淋巴转移的机制却不明确。K a r p a n e n 等憎1 研究结果还表明V E G F - C 可促进肿
15、瘤细胞的生长。并与癌周淋巴管的生长以及肿瘤细胞在淋巴管内的播散有关。几项临床研究也表明许多人类肿瘤可以分泌V E G F - C ，V E G F - C 表达与肺癌u0 1 、结肠癌u 以及头颈部肿瘤n 2 等的局部淋巴结转移明显相关。肿瘤淋巴管位于肿瘤周边和癌周组织，V E G F - C 可扩大这些淋巴管的直径和增加淋巴管数量，利于肿瘤转移。本研究发现，V E G F C 在胃癌细胞浆中表达，表达阳性率在淋巴结转移病例中较阴性组高。其表达与肿瘤发生淋巴结转移与否成显著性相关。在有淋巴结转移和淋巴管浸润的原发病灶中，V E G E - C 表达的阳性率明显高于无淋巴结转移者，说明V E G
16、 F - C 表达与淋巴管侵袭和淋巴结转移之间可能存在功能性的相关关系。肿瘤由原发部位脱落而发生转移，可以通过血液循环到达淋巴结门并在淋巴结中被捕获。侵入血管中细胞多，则淋巴结受累凡率高。肿瘤细胞也可以直接侵入淋巴管，原有及新生地淋巴管均将成为肿瘤细胞淋巴道转移地通道。由上可见，对于肿瘤来说，其微血管、微淋巴管数量将直接影响其淋巴结转移的发生n 3 1 。免疫组化结果显示，与V E G F - c 表达阴性病例比较，Y E G F - C 阳性病例淋巴管密度( L t W D ) 在癌周显著增高，经相关性分析发现，肿瘤边缘区域L - I V D 与肿瘤是否发生区域淋巴结转移成显著性正相关。因此，可以认为，在胃癌中，区域淋巴结转移的发生，与肿瘤细胞中V E G F - C
