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1、广西医科大学药学本科生毕业论文（设计）1药药学学本本科科生生毕毕业业论论 文文中文题目中文题目:HPLC 法测定盐酸左旋多巴甲酯片有关物质法测定盐酸左旋多巴甲酯片有关物质英文题目英文题目:DeterminationDetermination ofof relatedrelated substancessubstances inin L-dopaL-dopa methylmethyl esterester hydrochloridehydrochloride tablettablet byby HPLCHPLC学生姓名学生姓名: 学号学号： 专业专业:药学药学指导教师指导教师: 完成场所完成场所
2、:广西医科大学药学院实验中心广西医科大学药学院实验中心论文工作时间：论文工作时间：2012 年年 7 月月 至至 2013 年年 1 月月广西医科大学药学本科生毕业论文（设计）2HPLCHPLC 法测定盐酸左旋多巴甲酯片有关物质法测定盐酸左旋多巴甲酯片有关物质摘摘 要要 目的：建立盐酸左旋多巴甲酯片中有关物质的高效液相色谱测定方法。方法：色谱柱采用WondailTM C18柱(4.6 mm250 mm，5m)；流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾（磷酸调pH=3.5）：甲醇=80:20；流速：1.0 ml/min；检测波长：280nm；柱温：40；进样量20l。结果：有关物质各杂质峰与主峰之间
3、分离良好，最低检测限为1.25ng，最低定量限为4.13ng。结论：该方法简便，快速，结果准确，分离效果好，能作为盐酸左旋多巴甲酯片有关物质的测定方法。关键词关键词 盐酸左旋多巴甲酯片；有关物质；高效液相色谱法DeterminationDetermination ofof relatedrelated substancessubstances inin L-dopaL-dopa methylmethyl esterester hydrochloridehydrochloride tablettablet byby HPLCHPLCChen Shumei,Yang Ming,Huang Xing
4、zhen,Jiang Weizhe（School of Pharmacy，Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)ABSTRACT Objective:To establish an HPLC method for the determination of related substances in L-dopa methyl ester hydrochloride.Methods:The WondailTM C18 column (4.6 mm250 mm，5 m) was used, the mobile phase was 0.05
5、 mol/L potassium dihydrogen phosphate(adjust pH to 3.5 by phosphoric acid) methanol = (80 20) ，the flow was 1.0 mL /minThe detection wavelength was 280 nm，the column temperature was 40 and the injection volume was 20 L.Results: Related substances was separated well，and LOD was 1.25 ng，LOQ was 4.13ng
6、.Conclusion: The method is simple, accurate and good resolution. It can provided a new and reliable means of the quality control of determination of related substances in L-dopa methyl ester hydrochloride tablet.Key words: L-dopa methyl ester hydrochloride tablet; Related substance;HPLC盐酸左旋多巴甲酯（L-do
7、pa methyl ester hydrochloride）由左旋多巴甲酯化制成1，为抗震颤麻痹类神经性药物左旋多巴的前体药物，具有易溶于水、易进入血-脑屏障，吸收快，生物利用度高等优点2，但有关盐酸左旋多巴甲酯有关物质的测定方法目前报道广西医科大学药学本科生毕业论文（设计）3少见。 本文通过对照品对照法，采用 HPLC 法对左旋多巴甲酯片的有关物质进行了分析3，并对该方法进行了方法学验证，为完善其质量标准提依据。1 实验仪器与试剂1.1 实验仪器LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司） ； EL204型电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司） ； KQ-500DB超声仪（昆山市超声仪器有
8、限公司） ；TV-1901双光束紫外可见光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司） 。1.2 试药与试剂盐酸左旋多巴甲酯片（批号：20120714,20120715,20120716） ；盐酸左旋多巴甲酯对照品（广西医科大学药学院实验中心自制，纯度99.73） ；左旋多巴对照品（中国生物药品检定所，供含量测定用，100170-200303） ；磷酸二氢钾（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20110824） ；氢氧化钠(成都市科龙化工试剂厂，批号：20110524)；磷酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20110122） ；甲醇（色谱级，Fisher Scientific，批号：1117
9、73） ；过氧化氢（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20100901） ；盐酸（分析纯，成都市科龙化工试剂厂，批号：20121101） ；双蒸水（广西医科大学药学院实验中心自制） ；其他试剂均为分析纯。2 方法与结果2.1 色谱条件2.1.1 检测波长的选择:参考盐酸左旋多巴甲酯片原料有关物质项下色谱条件4，检测波长为280nm；取盐酸左旋多巴甲酯片细粉、原料以及处方量辅料，分别用流动相溶解并稀释成相当于每1ml约含盐酸左旋多巴甲酯55g的溶液；取左旋多巴用流动相溶解并稀释成相当于每1ml约含左旋多巴5g的溶液，将以上四份溶液在200-400nm波长范围内扫描紫外吸收图谱，辅料无吸收，盐酸
10、左旋多巴甲酯片细粉、原料以及左旋多巴在280nm处均有最大吸收，故确定280nm为盐酸左旋多巴甲酯片有关物质的检测波长。2.1.2 流动相的选择:参考盐酸左旋多巴甲酯片原料有关物质项下色谱条件4，即0.05mol/L磷酸二氢钾（磷酸调pH=3.5）：甲醇=80:20。2.1.3 系统适应性试验:色谱柱采用WondailTM C18柱(4.6 mm250 mm，5m)；流动相广西医科大学药学本科生毕业论文（设计）4为0.05mol/L磷酸二氢钾（磷酸调pH=3.5）：甲醇=80:20；流速为1ml/min；检测波长为280nm。取左旋多巴对照品溶液20l（约20g/ml）进样，理论塔板数按左旋多
11、巴峰计不低于1500） 。色谱图见附图1。2.2 杂质检查分析方法的选择采用高效液相色谱法对盐酸左旋多巴甲酯片的已知杂质进行测定。根据中国药典2010年版二部附录XIXF药物杂质分析指导原则5和化学药物杂质研究技术指导原则6的要求：已知杂质对主成分的相对响应因子在0.9-1.1范围内时，可用主成分的自身对照法计算含量，超出0.9-1.1范围时，宜选用对照品对照法计算含量。左旋多巴是盐酸左旋多巴甲酯片原料药的已知杂质，因此需要对左旋多巴和盐酸左旋多巴甲酯的响应因子进行测定。2.2.1 左旋多巴标准曲线的制备:取左旋多巴对照品约 20mg，精密称定，置于 100ml 容量瓶中，加流动相溶解并稀释至
12、刻度，摇匀。精密量取此溶液 0.5，1，2，5，10ml 分别置于 10ml 容量瓶中，以流动相稀释至刻度，分别得到浓度为10.2,20.4,40.8,102,204g/ml 的左旋多巴对照品溶液，按 2.1.3 色谱条件，分别进样20l，结果见表 2.1。广西医科大学药学本科生毕业论文（设计）5表 2.1 左旋多巴标准曲线测定结果（n=3）Table 2.1 L-dopa results determined by standard curve (n = 3)编号浓度（g/ml）峰面积平均RSD%1234510.220.440.81022041746991737021738203442223
13、42841342935688723691690692023170904417035021701520340797233984243406520174073.67343332.676908121704688.673404305.330.310.220.180.230.152.2.2 盐酸左旋多巴甲酯标准曲线的制备:取盐酸左旋多巴甲酯对照品约 20mg，精密称定，置于 100ml 容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取此溶液0.5,1,2,5，10ml 分别置于 10ml 容量瓶中，以流动相稀释至刻度，分别得到浓度为10.4，20.8，41.6，104,208g/ml 的盐酸左旋多巴甲
14、酯对照品溶液，按 2.1.3 色谱条件，分别进样 20l，结果见表 2.2。广西医科大学药学本科生毕业论文（设计）6表 2.2 盐酸左旋多巴甲酯标准曲线测定结果(n=3)Table 2.2 L-dopa methyl ester hydrochloride results determined by standard curve (n = 3)编号浓度（g/ml）峰面积平均RSD%1234510.420.841.61042081453681454761453682896062894142901675704505693005677811421798142530214231172847312284
15、223128345731454042897295691771423405.6728413720.040.140.240.120.23以峰面积A 对浓度C（g/ml）进行回归分析，得到左旋多巴、盐酸左旋多巴甲酯的 回归方程，分别为： A16661 C + 5873.3，r = 0.9999A13642 C + 3933.0，r = 0.9999左旋多巴对盐酸左旋多巴甲酯的响应因子左旋多巴标准曲线斜率/盐酸左旋多巴甲酯标准曲线斜率，计算得响应因子为 1.22，超出 0.9-1.1 范围，因此选用对照品对照法广西医科大学药学本科生毕业论文（设计）7计算含量。2.3 空白辅料干扰试验取处方量辅料，加流
16、动相超声溶解并稀释成相当于每1ml含2.5mg盐酸左旋多巴甲酯的辅料溶液，按2.1.3色谱条件进行测定，结果表明空白辅料不干扰测定。色谱图见附图2。2.4 分离度试验分别取左旋多巴甲酯片粉末与左旋多巴对照品适量，用流动相分别配成为浓度为12.56、10.20g/ml溶液，按2.1.3色谱条件进行测定；取盐酸左旋多巴甲酯片粉末溶液与左旋多巴对照品溶液适量，配成混合溶液，按2.1.3色谱条件进行测定。结果表明盐酸左旋多巴甲酯与左旋多巴能很好的分离。结果见附图3至5。2.5 破坏性试验42.5.1 酸破坏：取盐酸左旋多巴甲酯片（批号：20120716） ，研细，取细粉适量（相当于盐酸左旋多巴甲酯25mg） ，置于10ml容量瓶中，加入1.00mol/L盐酸溶液2ml，放置2h，用同浓度氢氧化钠溶液中和后，加流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液按2.1.3色谱条件进行测定。结果见附图6。取辅料适量，同法操作，结果表明辅料不干扰测定。2.5
