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1、牛乳中产耐高温蛋白酶嗜冷菌的分离及鉴定研究刘 敏 曹志军 李艳梅 （内蒙古农业大学职业技术学院 014109）摘要：摘要：本文采用单一性底物平板分离法和 Folin 法，观察其水解圈大小和测酶活力，从牛 乳中共获得 10 株产耐高温蛋白酶的嗜冷菌。对其菌体形态、染色反应、培养性状、生理生 化性状进行了系统研究, 鉴定结果表明,上述 10 个细菌菌株分别属于气单胞菌属 （Aeromonas） 、巴斯德氏菌属（Pasteurella） 、黄杆菌属(Flavobacterium)、变形菌属 （Proteus） 、节杆菌属（Arthrobacter） 、短杆菌属（Brevibacterium） 、微球
2、菌属 （Micrococcus） 、片球菌属（Pediococcus） 、乳球菌属（Lactococcus）和明串球菌属 （Trichococcus） 。 关键词关键词: 嗜冷菌; 耐高温蛋白酶; 分离; 鉴定Studies on Isolating of Identification of PsychrophiliesProducing Thermotolerant Protease in MilkLiu min Caozhijun Liyanmei （Vocational and technical college of inner Mongolia agricultural univer
3、sity 014109） Abstract:Ten strains of Psychrophilies that producing heatproof protin enzymes were screened out by prate separation and folin methods. Meanwhile, it can also observe their proteclytic circle and proteclytic activity to obtain them.,and were idendified. as Aeromonas, Pasteurella, Flavob
4、acterium, Proteus, Arthrobacter, Brevibacterium, Micrococcus, Pediococcus, Lactococcus and Trichococcus based on bacterial modality,deying reaction, cultural characteristics, physiological characteristics and biochemical reactions. Key words: Psychrophilies; Heatproof protin enzyme; Isolation; Ident
5、ification在低温条件下贮藏原料乳，会有嗜冷菌选择性的生长1。通常鲜乳中的嗜冷菌主要是由 于榨乳用具不清洁和杀菌不彻底而污染所致，它在最初的细菌总数中占 1050，在随 后的冷藏过程中很快成为优势菌株，进行生长繁殖和代谢活动从而引起冷藏乳的变质。并 且大多数嗜冷菌在低温贮藏时产生耐热性的胞外蛋白酶，这些酶类耐受高温处理，无法通 过单一的加热方法将其灭活，使乳制品产生凝胶、沉淀、苦味、酸败等不良现象的同时影 响产品的色泽。导致乳及乳制品风味和质地的变异，缩短保质期，从而影响产品的质量及 加工过程的顺利进行。 目前，引起鲜乳变质的嗜冷菌（种属）国内外文献均有报道，但是对贮藏及加工过程 中产耐
6、热蛋白酶的嗜冷菌株未见报道。本文从牛乳中分离出产耐热蛋白酶的嗜冷菌株数株， 对其进行培养及鉴定。为明确嗜冷菌的营养生理状况以及进一步探讨菌落对乳制品的影响 奠定基础，对嗜冷菌在乳中的研究找到了立足点，为生产上有效控制嗜冷菌数量、减少其 对乳的危害、提高乳品质量和安全性提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 乳样 样品以蒙牛、伊利、内蒙古农业大学牧场的原料乳为研究对象。用灭菌吸头采样器采样 2-3mL，带回实验室置 4冰箱备用。 1.1.2 培养基 LA 培养基、NB 培养基、PDA 培养基、金氏培养基 B(KB 培养基)5。 1.1.3 标准菌株 门多萨假单胞菌（Pseudo
7、monas mendocina）AS1086 购于中科院菌种保藏中心； 1.2 方法 1.2.1 产蛋白酶菌株分离方法：采用水解圈法初筛，应用管碟法和 Folin 试剂显色法进行复 筛。 1.2.2 产酶菌株的鉴定：选取产酶菌株 10 株,将分离纯化的 10 个菌株在 LA 培养基上培养 24h 后,进行培养性状和生理生化测定,并按照格兰氏染色法和 3%KOH 简易法6,测定其染色 反应;按照油镜观察和磷钨酸负染法电镜观察其菌体形态;同时将 10 个细菌菌株在 0、5、10、15、20、25等 6 个不同的温度,5.5、6、6.5、7、7.5、8 等 6 个不同氢离子浓 度(pH 值)和 0.
8、5%、3%、5%、7%、10%、15%等 6 个不同 NaCl 浓度条件下,接种培养不同 时间,测定其生长情况。根据菌体形态、电镜观察、染色反应、培养性状和生理生化测定,并 按伯杰氏细菌鉴定手册第八版等其他文献进行鉴定7-10。 2 结果 2.1 蛋白酶产生菌的筛选 从乳中共筛选到嗜冷菌 60 余株，经水解圈法筛选得到产低温脂肪酶的菌株 25 株，应 用管碟法和 Folin 试剂显色法进行复筛，发现只有 10 株菌株的酶活高于 20 U.mL-1，因此对 这 10 株菌进行鉴定。 2.2 菌体形态和培养性状 鉴定结果表明:10 个细菌菌株中有 3 个菌株呈格兰氏阴性反应, 7 个菌株呈格兰氏阳
9、性反 应,10 个菌株 6 个菌株为杆状，4 个菌株为球状。将分离纯化的供试菌在 NA 和 NB 培养基 上,15培养 72h 后观察记载,10 个菌株在两种培养基各呈不同的表现(表 1)。由表 1 可知,供 试细菌菌株在 GXY 型智能光照培养箱和 YQX 型厌氧培养箱中培养 72h,对氧气需求 9 号菌 株兼性偏厌氧,其余菌均表现为好氧。从电镜下观察,1 号菌株为周生鞭毛,4 号菌株为端生鞭 毛,其他菌株均无鞭毛。 2.2 供试细菌菌株生理性状 供试细菌菌株在不同温度()、不同氢离子浓度(pH 值)和不同 NaCl 浓度条件下,接种培 养不同时间,观察检查记载结果(表 2)。从表 2 可知
10、,供试菌株在不同温度、不同 pH 值和不 同 NaCl 浓度下培养,除 1、3、7、8 号菌株在 0不生长，在 0-25温度范围内 10 株菌均 能生长。所有菌株在 pH7.0-8.0、0.5%-5.0%NaCl 条件下生长良好。 2.3 供试菌株生化性状 对供试 10 个供试菌株生化性状测定,氧化酶等 7 种,6 种氮素化合物和糖醇以及其他碳素 化合物 22 种,其试验结果见表 3。从表 3 试验结果可知,供试 10 个菌株,氧化酶 10 号菌株阳 性, 其他菌株均为阴性;过氧化氢酶阳性,肌醇阳性反应,除 8 号菌株不能利用鼠李糖,其他菌 株均能利用 17 种糖类。同时 10 个菌株其他生化
11、测定项目各异。 2.4 细菌菌株鉴定 经对应检查菌体形态、染色反应、培养性状、生理生化反应等各项指标鉴定,可知上述 10 个细菌菌株依次分别属于气单胞菌属（Aeromonas） 、巴斯德氏菌属（Pasteurella） 、黄杆 菌属(Flavobacterium)、变形菌属（Proteus） 、节杆菌属（Arthrobacter） 、短杆菌属 （Brevibacterium） 、微球菌属（Micrococcus） 、片球菌属（Pediococcus） 、乳球菌属 （Lactococcus）和明串球菌属（Trichococcus） 。表 1 筛选菌落特征及革兰氏染色结果Table1 charac
12、teristics of bacterial Screening and results of gram reaction菌株号菌体形状革兰氏 染色反应鞭毛需氧情况菌落特征1杆状G-周生好氧淡白色圆形、表面光滑、边缘整齐、分泌水 溶性色素2杆状G-无好氧橙色圆形、表面湿润、边缘缺刻状3杆状G-无好氧乳脂色圆形、表面光滑透明、边缘整齐4杆状G+端生好氧乳清色根状扩展、表面皱褶、边缘裂叶状5杆状G+无好氧乳清色圆形、表面光滑、边缘波状6杆状G+无好氧淡白色圆形、表面光滑、边缘不整齐7球状G+无好氧乳脂色不规则、表面波状皱褶、边缘缺刻状8球状G+无好氧淡白色圆形、菌落小、表面光滑、边缘整齐9球状G+
13、无兼性厌氧淡白色圆形、菌落小、表面光滑、边缘整齐10球状G+无好氧乳脂色圆形、菌落小、表面光滑、边缘裂叶 状1)+表示阳性;-表示阴性。表 2 筛选菌落生理性状Table2 Physiological characteristics of bacterial Screening1)+表示阳性;-表示阴性。表 3 筛选细菌生化反应Table3 Biochemical reactions of bacterial Screening菌 株生化反应类型12 345678910CK氧化酶+W+-+过氧化氢 酶+-+-+苯丙氨酸 脱氨酶+- -色氨酸脱 氨酶-+-+-赖氨酸脱 羧酶+W-+-+精氨酸双
14、水解酶+-+脲酶-+-+-脂酶+-+-硝酸盐还 原+-+-+H2S 产生-+-+-吲哚产生-+-V-V+甲基红 (M.R)试验-+-+-V-V.P.试验-明胶液化+-+-+W+-+石蕊牛奶A lP eP eA lP eS oP eP eA lS oSo淀粉水解+-V-葡萄糖+-+W+-+蔗糖-+-V-+-乳糖-+-+-麦芽糖+-+纤维二糖+-V-+-+阿拉伯糖+-+-木糖-+-+-鼠李糖-海藻糖+-+-+棉籽糖-半乳糖-+-+果糖-+-+甘露糖+-+-+甘露醇+-+-山梨醇-+W-卫矛醇-肌醇-+-+-水杨素+-+七叶灵水 解-+-+- -丙二酸钠+-+-+-+柠檬酸钠-+-+琥珀酸钠-+-+
15、-苹果酸钠+马尿酸钠- +-氨基乙酸+-+-注： +：阳性 Postive； ：阴性 Negative； +w：弱阳性 Weak postive； v：可 变的 Variable； Re：还原 Reduction； Pe：胨化 Peptonigsation； Al：产碱 Alkaline； So：凝固 Solidify。 3 小结与讨论 本研究从原料乳中共分离、纯化获得 10 个属的产耐高温蛋白酶的细菌菌株,分别属于气 单胞菌属（Aeromonas） 、巴斯德氏菌属（Pasteurella） 、黄杆菌属(Flavobacterium)、变形菌 属（Proteus） 、节杆菌属（Arthrobacter） 、短杆菌属（Brevibacterium） 、微球菌属 （Micrococcus） 、片球菌属（Pediococcus） 、乳球菌属（Lactococcus）和明串球菌属 （Trichococcus） 。由于实验条件的限制,本文只对同一地区来源原料乳进行了分离实验,而不 同地区来源的原料乳会因食性和所生长的环境之
