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1、自主实验设计自主实验设计牛血清中白蛋白的提取与鉴定牛血清中白蛋白的提取与鉴定组员组员: : 龙龙 腾腾11201503191120150319肖红利肖红利11201503201120150320张又心张又心11201503211120150321唐唐 静静11201503231120150323胡祖倩胡祖倩11201503241120150324朱朱 宇宇11201503251120150325班级班级: : 20112011 级临床科技级临床科技33班班 年年 月月 日日 实验目的：实验目的：1.1. 通过牛血清白蛋白的提取与鉴定，掌握盐析、离心、电泳、及呈通过牛血清白蛋白的提取与鉴定，掌握
2、盐析、离心、电泳、及呈色反应的原理及应用。色反应的原理及应用。2.2. 通过实验掌握实验的基本操作、原理及为以后的学习打下坚实的通过实验掌握实验的基本操作、原理及为以后的学习打下坚实的基础。基础。实验原理：实验原理：牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml38g/100ml） ，分子量，分子量 68kD68kD。等电点。等电点 4.84.8。应用相同浓度硫酸铵盐。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。本实验
3、用盐析、离心、透析、电泳及呈色反应来分离、提取白蛋白。本实验用盐析、离心、透析、电泳及呈色反应来分离、纯化及鉴定牛血清白蛋白。首先用盐析初步分离，在半饱和硫酸铵纯化及鉴定牛血清白蛋白。首先用盐析初步分离，在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白沉淀下来，经离心后上清液中含白蛋白。第二溶液中，血清球蛋白沉淀下来，经离心后上清液中含白蛋白。第二步用玻璃纸利用透析原理通过不断改变膜内外的浓度差让膜内的盐步用玻璃纸利用透析原理通过不断改变膜内外的浓度差让膜内的盐离子不断溢出达到纯化的目的，得到较纯的白蛋白。第三步利用电离子不断溢出达到纯化的目的，得到较纯的白蛋白。第三步利用电泳将蛋白彻底分离。最后，将其与标准
4、膜一起染色，漂洗，进行对泳将蛋白彻底分离。最后，将其与标准膜一起染色，漂洗，进行对比即可达到鉴定的目的。比即可达到鉴定的目的。实验步骤：实验步骤：1.1.盐析盐析 取取离心管一支加入离心管一支加入小牛血清小牛血清 0.5ml+PBS0.5ml+PBS 液液 0.5ml+pH7.20.5ml+pH7.2 饱和硫酸铵饱和硫酸铵2ml2ml，充分混合均匀，静置，充分混合均匀，静置 20min20min，2500r/min2500r/min 离心离心 10min10min。2 2、透析、透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线
5、扎紧上口（注意要留有空隙）上口（注意要留有空隙） ，放入有自来水的小烧杯中透析，放入有自来水的小烧杯中透析，使透析袋使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外液体，下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，并不断用纳氏试剂检查袋外液以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，并不断用纳氏试剂检查袋外液体的体的 NHNH4 4+ +，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。入试管，即得牛血清白蛋白溶液。3 3、点样与电泳、点样与电泳.取两条取两条 2.5c
6、m2.5cm x x 8.0cm8.0cm 的膜条，将膜条无光泽面向下，放入培的膜条，将膜条无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中冲锋浸透。养皿中的巴比妥缓冲液中冲锋浸透。将充分浸透的两条膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，将充分浸透的两条膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的光泽面距一端以醋纤膜的光泽面距一端 1.5cm1.5cm 处作为点样线，并用铅笔在上面编处作为点样线，并用铅笔在上面编好号好号 A.BA.B。用两个点样器分别在标准液和测定液中沾一下，点样器下端粘用两个点样器分别在标准液和测定液中沾一下，点样器下端粘上薄层标准液和样液，然后将点样器竖直，进行点样。上薄层标
7、准液和样液，然后将点样器竖直，进行点样。将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时膜条无光泽面向下，将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时膜条无光泽面向下，点样端置于阴极，膜条与滤纸贴紧，待平衡后，打开电源，调节电点样端置于阴极，膜条与滤纸贴紧，待平衡后，打开电源，调节电泳仪，使两极间距的电压为泳仪，使两极间距的电压为 15v/cm15v/cm，通电，通电 60min60min，关闭电源后用镊，关闭电源后用镊子将膜条取出。子将膜条取出。直接浸于盛有氨基黑直接浸于盛有氨基黑 10B10B 的染色液中，染的染色液中，染 2min2min 取出，立即浸于取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液中，分别在 1 1
8、、2 2、3 3 漂洗液中各漂洗漂洗液中各漂洗 5min5min，直至背景漂净为，直至背景漂净为止。用干滤纸吸干薄膜。止。用干滤纸吸干薄膜。观察两张薄膜的颜色。比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的观察两张薄膜的颜色。比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。电泳结果，看位置是否一致。预测结果预测结果 ： 位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。白的黑带区域，则说明提取不够纯。实验材料：实验材料：1.1.器材器材电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽内有两个电泳仪：包括
9、直流电源整流器和电泳槽两个部分，电泳槽内有两个电极（用铂丝制成）电极（用铂丝制成） 。培养皿、试管、醋酸纤维素薄膜。培养皿、试管、醋酸纤维素薄膜 2 2 张、玻璃纸张、玻璃纸1 1 张、烧杯、离心机张、烧杯、离心机2.2.试剂试剂牛血清待测液、牛血清样品、牛血清待测液、牛血清样品、PBSPBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L0.01mol/L 磷酸盐缓冲液（磷酸盐缓冲液（pH7.2pH7.2）配制的）配制的 0.9%NaCl0.9%NaCl 溶液）溶液） 、pH7.2pH7.2饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑 10B10B 染色液、染色液、漂洗液漂洗液参考书目：参考书目：生物化学实验生物化学实验上海交通大学出版社，上海交通大学出版社，20052005 版版生物化学实验生物化学实验中国医药科技出版社，中国医药科技出版社，20072007 版版生物化学实验教程生物化学实验教程军事医学科学出版社，军事医学科学出版社，20042004 版版生物化学与分子生物学实验教程生物化学与分子生物学实验教程第四军医大学出版社，第四军医大学出版社，20102010 版版
