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1、第一节 概 述 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒 载体中,一般缺乏此种转移所必需的 mob 基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞 的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌,需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以 摄取外源 DNA。转化(Transformation)是将外源 DNA 分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种 手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株,即不含限制性内切酶和 甲基化酶的突变体(R,M),它可以容忍外源 DNA 分子进入体内并稳定地遗
2、传给后代。受 体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通 透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源 DNA 分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 进入受体细胞的 DNA 分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性 状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养,即可筛选出转化子(Transformant,即带有异 源 DNA 分子的受体细胞)。目前常用的感受态细胞制备方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl)法, RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但 CaCl2 法简便易行,且其转化效率完
3、全可以 满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积 15的无菌甘油于-70保存(半年),因此 CaCl2 法为使用更广泛。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素: 1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于的培养菌,最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数 生长期时为好,可通过监测培养液的 OD600 来控制。DH5 菌株的 OD600 为 0.5 时,细 胞密度在 5107 个/ml 左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均 会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的
4、质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA(cccDNA)。转化 效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大 时,转化效率就会降低。1ng 的 cccDNA 即可使 50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下, DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的 5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如 CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或 AR.),并用超纯水配 制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂 DNA 的污染:整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离 心管, tip 头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且
5、注意防止被其它试剂、 DNA 酶或杂 DNA 所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定 带来不必要的麻烦。 本实验以 E.coli DH5a 菌株为受体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质 粒共保温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过 Amp 抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS,则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培 养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提 取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。本实验以 E.coli DH5a 菌株为
6、受体细胞,并用 CaCl2 处理,使其处于感受态,然后与 pBS 质 粒共保温,实现转化。由于 pBS 质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr ),可通过 Amp 抗性来 筛选转化子。如受体细胞没有转入 pBS,则在含 Amp 的培养基上不能生长。能在 Amp 培 养基上生长的受体细胞(转化子)肯定已导入了 pBS。转化子扩增后,可将转化的质粒提 取出,进行电泳、酶切等进一步鉴定。 第二节 材料、设备及试剂 一. 材料E. coli DH5 菌株: R,M,Amp;pBS 质粒 DNA: 购买或实验室自制,eppendorf 管。 二. 设备 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台
7、,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。 三. 试剂 1.LB 固体和液体培养基:配方见第一章。 2.Amp 母液:配方见第一章。 3.含 Amp 的 LB 固体培养基:将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至 60左右,加 入 Amp 储存液,使终浓度为 50ug/ml,摇匀后铺板。 4.麦康凯培养基(Maconkey Agar):取 52g 麦康凯琼脂,加蒸馏水 1000ml,微火煮沸至完全 溶解,高压灭菌,待冷至 60左右加入 Amp 储存液使终浓度为 50ug/ml,然后摇匀后涂板。 5.0.05mol/L CaCl2 溶液:称取 0.28g CaCl2(无水,
8、分析纯),溶于 50ml 重蒸水中,定容至 100ml,高压灭菌。6.含 15%甘油的 0.05mol/L CaCl2: 称取 0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于 50ml 重蒸水中, 加入 15ml 甘油,定容至 100ml,高压灭菌。 第三节 操作步骤 一、 受体菌的培养 从 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 单菌落,接种于 3-5ml LB 液体培养基中,37 下振荡培养 12 小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以 1:100-1:50 的比例接种于 100ml LB 液体培养基中,37振荡培养 2-3 小时至 OD600 0.5 左右。 二、 感受态细胞的
9、制备 ( CaCl2 法) 1、将培养液转入离心管中,冰上放置 10 分钟,然后于 4下 3000g 离心 10 分钟。2、 弃去上清,用预冷的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液 10ml 轻轻悬浮细胞,冰上放置 15-30 分钟后,4下 3000g 离心 10 分钟。 3、弃去上清,加入 4ml 预冷含 15%甘油的 0.05mol/L 的 CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上 放置几分钟,即成感受态细胞悬液。4、 感受态细胞分装成 200l 的小份,贮存于-70可保存半年。 三、 转化 1、从-70冰箱中取 200l 感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。2、 加入 p
10、BS 质粒 DNA 溶液(含量不超过 50ng,体积不超过 10l),轻轻摇匀,冰上放置 30 分钟后。 3、42水浴中热击 90 秒或 37水浴 5 分钟,热击后迅速置于冰上冷却 3-5 分钟。 4、向管中加入 1ml LB 液体培养基(不含 Amp),混匀后 37振荡培养 1 小时,使细菌恢 复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、将上述菌液摇匀后取 100l 涂布于含 Amp 的筛选平板上,正面向上放置半小时,待 菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37培养 16-24 小时。 同时做两个对照: 对照组 1: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,其它操作与上
11、面相同。此组正常情况 下在含抗生素的 LB 平板上应没有菌落出现。 对照组 2: 以同体积的无菌双蒸水代替 DNA 溶液,但涂板时只取 5l 菌液涂布于不含 抗生素的 LB 平板上,此组正常情况下应产生大量菌落。 四、 计算转化率 统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子,根据此皿中的菌落数可计算出转 化子总数和转化频率,公式如下: 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率(转化子数每 mg 质粒 DNA)转化子总数质粒 DNA 加入量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数 注意 本实验方法也适用于其它 E.coli 受体菌株的不同的质粒 DNA 的转化。但它们的转 化效率并不一定一样。有的转化效率高,需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落 平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。 思考题 1. 制备感受态细胞的原理是什么? 2. 如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落,你将如何解释这种现 象?