《真菌dna提取及扩增方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《真菌dna提取及扩增方法（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一 真菌DNA提取方法取已纯化的真菌菌丝。采用改良氯化苄法提取DNA。具体方法如下： （1）0.1g菌体，在1.5ml 离心管中加入500 L DNA提取液，先振荡使之充分混匀。 （2）10%SDS100 L和300L 氯化卞，剧烈振荡，涡旋混匀，使管内混合物成乳状。 （3）于 56 水浴保温 1h，每隔 10min 振荡混匀一次。 （4）加入 3M 醋酸钠（pH5.2）300L，冰浴 15min12000rpm，4 离心 15min。 （5）收集上清液（约 600L，记住收集的上清液的体积），放入另一新离心管中，再加 入等体积的氯仿：异戊醇（V：V=24:1）剧烈振荡使之充分混匀，并形成悬乳
2、状。 12000rpm，4 离心 15min。 （6）如上 5 操作再抽提一次，移至另一新离心管中。 （7）加入两倍体积的冷无水乙醇，上下转动混匀，放入-20 冰箱过夜，使 DNA 沉淀。（8）12000rpm，4 离心 15min，收集沉淀。 （9）沉淀用 1000L75%冷乙醇洗涤 5min，重复两次，然后弃去冷乙醇。 （10）真空干燥，将 DNA 溶于 50LTE 缓冲液或 ddH2O 中，4 冰箱保存备用。二 真菌的PCR扩增以提取的基因组 DNA 为模板，用真菌通用引 物 ITS4（5- TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3）和 ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGT
3、AACAAGG- 3)对 真菌 rDNA 的 ITS 区域利进行 PCR 扩增。 PCR 反应体系（25）L：PCR Buffer maxture 2.5L；10mmol/L dNTP 1L；引物 ITS4/ITS5(10mol/L)各 1L；模板 DNA 2L；5U/L TaqDNA 聚合酶 0.4L；ddH2O 17.1L。PCR 反应程序：95预变性 4min，94变性 30s，53复性 30s，72延伸 40s， 进行 35 个循环，最后 72延伸 7min，用无菌水代替模板作阴性对照，PCR 产物-20保存。细菌和古菌4.1.1.1 酶法小量酶法小量 DNA 提取提取150mg 菌体
4、(或直接用竹签挑取纯菌落)于 EP 管中，加 1TE480ul，稀释成20mg/ml 的溶菌酶 20L，放入 37摇床 23 小时；2加 20%SDS 50L 及蛋白酶 pK 5L 震荡混匀 1 分钟, 放入 55摇床（或烘箱）30-60 分钟pK 浓度为 20ug/mL ；3加 550 L 苯酚:氯仿:乙戊醇（25：24：1）取下层, 震荡混匀，12000rpm 离心 10 分钟, 吸取上清液(不要吸到中间渣滓，重复抽提 2 次)；4上清液加入 50 L 3mol/L 乙酸钠(PH 4.8-5.2)混匀后加 500 L 异丙醇，放入-20冰箱 1-2 小时或过夜；或者加 800ul 无水乙醇
5、，加 80L 3mol/L 乙酸钠(PH 4.8-5.2)室温放置 10 分钟以上；512000 rpm 离心 10 分钟，去除上清液,加 200L 70% 乙醇，轻摇洗盐 12次，12000 rpm 低温离心 5 分钟，弃乙醇；6(37-55)干燥后加 1TE 50L 溶解 DNA(视 DNA 量而定), -20保存备用。注意干燥时间不宜过长，一般 20-30min，时间太长，DNA 不宜溶解。4PCR 引物细菌及放线菌 PCR 引物采用通用引物 PA/PB，序列为：正向引物 PA: 5-CAG AGT TTG ATC CTG GCT-3反向引物 PB: 5-AGG AGG TGA TCC
6、AGC CGC A-3古菌引物：正向引物 P1: 5-ATT CCG GTT GAT CCT GCC GGA-3反向引物 P2: 5-AGG AGG TGA TCC AGC CGC AG-3引物由 Sangon 公司合成。5PCR 扩增PCR 反应采用热启动程序。PCR 所用的 10Buffer、Taq DNA 聚合酶、dNTP均购自昆明好科迪经贸有限公司。反应体系如表 1 所列。表 4-1 PCR 反应体系10Buffer5.0uLdNTP4.0uL PA1.0uL PB1.0uL Taq 酶0.3uL D.D.Water37.7uL DNA Template1.0uL 加石蜡油30uL6PCR 反应条件采用热启动 PCR 反应程序，PCR 仪采用 Biometra 公司产品。反应条件如表 2 所列。表 4-2 PCR 反应条件 95预变性4min 80暂停加酶 95变性1min 56退火1min 72延长2min 30 个循环72延长10min 4保存24h一般盖子的温度为 99
