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1、1第五章间接凝集反应技术(Indirect agglutination reaction technique) 一、概述（一）原理可溶性抗原（或抗体）吸附于免疫学反应无关的颗粒（称为载体）表面上，当这些致敏的颗粒与相应的抗体（或抗原）相遇时，就会产生特异性的结合，在电解质参与下，这些颗粒就会发生凝集现象。这种借助于载体的抗原抗体凝集现象就叫做间接凝集反应。载体的存在使反应的敏感性得以大大提高。间接凝集反应的优点为：敏感性强：间接凝集反应是最敏感性的血清学反应方法之一，可以检测到微量的抗体和抗原；快速：一般 1h 2h 即可判定结果，若在玻板上进行，则只需几分钟；特异性强；使用方便、简单。（二）
2、载体具有吸附抗原（或抗体）的载体很多，如聚苯乙烯乳胶、白陶土、活性炭、人和多种动物的红血球、某些细菌等。良好载体有如下几点基本要求：在生理盐水或缓冲液无自凝倾向；大小均匀；比重与介质相似，短时间内不能沉淀；无化学或血清学活性；吸附抗原（或抗体）后，不影响其活性。目前应用最广的是人的O 型红血球和绵羊红血球。而后者应用更广，因为其来源方便。另外绵羊红血球的表面有大量的（约1 000 个以上）糖蛋白受体，极易吸附某些抗原物质，吸附性能好，且大小均匀一致。（三）间接凝集的分类1根据载体的不同，可分为间接炭凝、间接乳胶凝集和间接血凝等。2根据吸附物不同可分为间接凝集反应（吸附抗原） 和反向间接凝集反应
3、（吸附抗体）。3根据反应目的不同，又可分为间接凝集抑制反应和反向间接凝集抑制反应。24根据用量和器材的不同又可分为试管法（全量法）、凹窝板法（半微量法）和反应板法（微量法） 。二、间接炭凝反应（一）原理间接炭凝集反应简称炭凝。它是以炭粉微粒作为载体，将已知的抗体球蛋白吸附于这种载体上，形成炭粉抗体复合物，当炭血清与相应的抗原相遇时，二者发生特异性结合，形成肉眼可见的炭微粒凝集块。目前炭凝反应已用于炭疽、鼠疫和马副伤寒性流产等病的诊断。（二）材料与试剂1炭粉炭粉粒子最好大小在0.12mm0.15mm，目前市场上出售的炭粉均不合要求，必须过300 目寸的标准筛以300r min 离心去沉淀，再以3
4、 000rmin离心去上清，收集沉淀物。2高免血清3待测标本4灭活兔血清5正常血清6标准抗原70.05mol/L pH7.2PBS 液81硼酸的PBS 液 （三）操作方法1炭致敏取湿炭粉 0.25g（干粉 0.10g） ，加入经 56 60灭活 30min 的稀释高免血清3ml，充分摇匀，置37致敏 30min ，不时摇动，取出后用pH 7.2 PBS液洗涤 3 次。最后一次用含1硼酸和1兔血清的PBS 液洗涤一次， 离心去上清，再取此液3ml，混匀即可。同时以正常血清致敏的炭粒处理，以作对照。致敏血清（加1/万硫柳汞防腐）于室温或4冰箱中保存，一年内有效。2取洁净玻璃板一块，以玻璃铅笔划成小
5、格，加被检标本0.10ml，再加免疫炭血清 0.05ml，充分混匀，静止1min5min ，判定结果。同时设三个对照：免疫炭血清 +标准抗原。正常炭血清 +标准抗原。3正常炭血清加待检抗原。（四）结果判定在对照完全成立的情况下，判定本试验结果：“” ：炭粉全部凝集，液体完全清亮透明。“”：炭粉大部分凝集，液体透明。“”：炭粉一半凝集，液体较透明。“”：炭粉微凝集，但与对照有差别，液体混浊。“”：炭粉不凝集，液体不透明。炭凝以“”做为反应滴度的终点。三、反向间接乳胶凝集反应（一）原理同炭凝，只是载体换为聚苯乙烯乳胶，它是一种由0.6 m0.7 m 的颗粒所组成的胶体溶液，具有良好的吸附蛋白质的性
6、能。间接乳胶凝集目前已用于鼠疫菌、沙门氏菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌、葡萄球菌肠毒素等的诊断。（二）材料与试剂1聚苯乙烯乳胶2免疫血清3正常血清4标准抗原5待检抗原60.02Mol/L pH8.2硼酸缓冲液硼砂6.67g 硼酸8.04g H2O 加至1 000ml 7生理盐水（三）操作方法1乳胶液制备取聚苯乙烯乳胶0.10ml，加灭菌蒸馏水0.40ml，再加pH8.2硼酸缓冲液2ml，混合后即为25 倍稀释的乳胶液。42 乳胶致敏在上述乳胶液中滴加稀释的免疫血清0.20ml0.70ml， 边加边摇，当出现肉眼可见的颗粒后，仍继续加血清，直至颗粒消失，成为均匀的乳胶悬液为止。镜下检查应无自凝。使用
7、时，应与一定稀释度的相应抗原出现阳性反应，与生理盐水出现阴性反应为合格。加防腐剂后，于冰箱内保存。注意防止冰冻。同时以正常血清代替免疫血清进行乳胶致敏，以作对照。3取洁净玻板一块，用玻璃铅笔划成小格，滴加待检样品0.10ml，再滴加高免血清致敏乳胶0.01ml，以牙签或火柴杆混匀，在3min 内判定结果。（四）结果判定“”：全部乳胶凝集，成絮状团块，液体清亮。“”：大部分乳胶凝集成较小的颗粒，液体清亮。“”：半量乳胶凝集成细小颗粒，液体混浊。“”：较少量的乳胶凝集成可见的细颗粒，液体混浊。“”：全部乳胶仍为均匀液体，无颗粒。以“”作为该反应滴度的终点。四、间接红血球凝集反应间接红血球凝集反应（
8、简称间接血凝） 是间接凝集反应中应用最广的一种方法。（一）原理以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。（二）材料与试剂1红血球2反应板分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96 孔和 72 孔两种规格。按孔型又可分为V 和 U 型两种， V 型具有更典型的凝集模
9、型， U 型有时比V 型的血清效价高12 孔。反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。消毒可用0.5甲醛溶液， 1新洁尔灭及紫外线照射等。53稀释棒由合金制成。棒头有8 条沟，吸液量为0.025ml，通过火焰，使表面氧化变粗易于吸取液体。它的作用是蘸取、转移、混合液体。为了长期保持棒头的氧化层，每使用20 次左右，应过火焰一次。4标准滴管每滴 0.025ml。5微型振荡器6 兔血清盐水作为稳定剂， 用于悬浮致敏红血球以及稀释供试血清。制法为：无菌采取兔血，收集血清，灭活后4保存。同时，取所需量加4 倍量的 2.5血球悬液，混匀，37水浴 10min，以吸附异嗜性凝集素，离心后取上清； 再以 pH
10、7.2PBS稀释成 1兔血清盐水，冰箱保存可供数日内之用。7抗原尽可能使用高纯度的抗原。8供试血清或其它含抗体材料供试血清必须灭活，加9 倍 2.5的红血球悬液， 37水浴 10min 20min，进行吸收，然后离心，取上清，即为1: 10 的血清稀释液。9醛化剂甲醛、戊二醛、丙酮醛等。10优质鞣酸110.15Mol/L pH6.4PBS 液，用于红血球致敏。120.15Mol/L pH7.2PBS 液，用于一般稀释液。130.02牛血清白蛋白PBS 液14生理盐水（三）红血球的处理1新鲜红血球新鲜红血球用阿氏液保存于4，可供 3 周内使用。采用新鲜红血球做凝集反应，模型新鲜， 典型，而且敏感
11、性也比醛化红血球高出12 个滴度。但用新鲜红血球致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红血球均有差异，影响试验结果和分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化红血球或鞣化红血球。2红血球醛化极其优点（1）醛化方法：常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。甲醛醛化过程：将红血球用pH7.2PBS 反复洗涤4 次，以除去血清蛋白以及红血球表面的胶体物质；按18 的比例取红血球（压积）和3甲醛液（用pH7.2PBS 稀释，预先冷却至4） ，缓慢混合，加胶塞4作用 24h，不时摇动；倾去上清液，再以12（VV）加入 36 38冷的（ 10）甲醛溶液，混匀，再放入 424h；离心去上清，以生理盐水
12、反复洗涤4 次。彻底清除甲醛液，最后以生理盐水配成10悬液甲醛化红血球，加1万硫柳汞防腐，4保存。戊二醛醛化过程： 取新鲜红血球， 以生理盐水洗涤4 次； 以 0.15Mol/L pH 7.2 6PBS 配成1戊二醛溶液，4保存备用；将100ml 1冰冷的戊二醛液加入到10ml15ml 红血球中，边加边搅拌（也可置电磁搅拌器上）30min；离心去上清，以生理盐水洗涤4 次，最后以PBS 液（或生理盐水）配成10悬液，加1万硫柳汞， 4保存。丙酮醛甲醛双醛化过程：取新鲜红血球，洗涤4 次，配成8的悬液；于红血球悬液中加等量的3丙酮醛室温电磁搅拌16h18h；洗涤5 次，再配成8的悬液；于红血球悬
13、液中加等量的3甲醛，电磁搅拌16h18h；洗涤5次，最后以pH 7.2 PBS 配成 10的悬液，加1万硫柳汞防腐，4保存。（ 3）醛化红血球的优点：性质稳定，不影响红血球表面的吸附能力；重复性好，易标准化。可较长期保存，醛化后4保存，有效期可至1 年，如冻干保存，有效期则更长。（ 4）影响醛化的因素：红血球的洁净程度：由于红血球表面残留血浆蛋白和其它胶质，易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；红血球的浓度：醛化时应尽量使红血球稀释度低一些，以减少红血球的凝集和变形；醛化时的温度与醛化红血球的质量有很大关系，一般认为最好是37。但有人认为应于4进行醛化；醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大，
14、易引起红血球皱褶，浓度过低，又会增加溶血机会， 所以一般以3醛化浓度为宜。 家禽红血球一般醛化12 次即可，而哺乳动物红血球醛化2 次比醛化1 次要好，敏感性高，保存时间也长。不同的双醛化，其抗原致敏作用有所不同，表5 1 是各种双醛化法的结果比较。表 51 各种双醛化红细胞的结果比较双 醛 化上海第六人民医院首都医院国外资料抗原滴度抗原滴度脉冲 min 抗原滴度脉冲 min 丙酮醛甲醛戊二醛丙酮醛丙酮醛戊二醛217 219215 21151075118 2106 6106 61061684 2154 3750 脉冲 min 是131I 标记的特异性抗体结合到细胞上的指标，脉冲数越大，结合抗体
15、量也越多。但是从表51 中可以看出结合量同可测出的抗原滴度是不平行的。适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形成。但过分地振荡， 则易产生气泡，引起红血球变形。3红血球鞣化多糖、 脂多糖、 类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。有人认为双醛化后可不必进行鞣化。首都医院做了“丙酮醛甲醛鞣化”和7不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多数意见认为醛化后仍需鞣化比较好。(1) 鞣化过程：将10醛化红血球用生理盐水洗涤2 次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS 洗涤 1 次，最后以PBS 配成 2.50悬液；称取优质鞣酸20mg，以生理盐水 4ml 配成 1200 的浓度，于37水浴，使之充分溶解，然后再以pH7.2PBS稀释成 12 000 的浓度。当天配制、当天用完；1 份 2.5红血球悬液与1 份 12 000 鞣酸液充分混合，37水浴 10min，1 500rmin 离心，去上清，用PBS 液洗涤 1 次；以 0.02牛血清白蛋白PBS 液洗涤 1 次，最后以牛血清白蛋白PBS 配成 2.5鞣化红血球。（ 2）影响鞣化的因素：鞣酸的质量：这是很重要的，所以必须采用优质鞣酸。分析纯的鞣酸呈面包屑状
