《如何通过伽马辐射提高免疫测定灵敏度抗HIV酶联免疫吸附测定中的聚苯乙烯表面的改性应用及表征》由会员分享，可在线阅读，更多相关《如何通过伽马辐射提高免疫测定灵敏度抗HIV酶联免疫吸附测定中的聚苯乙烯表面的改性应用及表征（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、如何通过伽马辐射提高免疫测定灵敏度：抗如何通过伽马辐射提高免疫测定灵敏度：抗 HIVHIV1 1 酶联免疫吸酶联免疫吸附测定中的聚苯乙烯表面的改性、应用及表征附测定中的聚苯乙烯表面的改性、应用及表征摘要摘要：经60CO 射线辐射的改性聚苯乙烯（PS）微量滴定板用于间接酶联免疫测定抗人类免疫缺陷病毒 1 型（抗 HIV1） 。用 9 kGy（最佳剂量）辐射过的板在血清学诊断试验中表现出比未处理组高 25 倍的检测灵敏度，并且比控制组低 3 倍的酶浓度仍是可检测的。吸附/解析实验结果、原子力显微镜（AFM）图像和 X射线光电子能谱（XPS）分析为这种性能提升提供了证据。在辐射期间形成的氧化表面对包
2、被抗原呈现出更高的结合亲和力，并能均匀地吸附更大量（1.53 倍）的蛋白质。关键字关键字：ELISA，射线辐射，HIV1，聚苯乙烯表面，蛋白吸附前言前言PS 微量滴定板常作为酶联免疫吸附测定（ELISA）中蛋白质吸附的固相载体，现在作为一种成熟的技术已被广泛应用于生物科学和医学实验室诊断。由于这种检测方法是基于固相免疫反应，所以生物活性化合物对板的吸附是非常重要的。然而，由于小分子几乎没有结合位点，所以低分子量的抗原/抗体很难通过随机吸附固定在PS 表面。PS 表面和小分子蛋白的弱相互作用限制了 ELISA 测定法的灵敏度。通常，在 PS 表面这种类型的固定要涉及共价偶联步骤，因蛋白质不适当的
3、构象呈递和定向，这是耗时的并且可能改变抗原表位。为了保持它们的构象和生物活性，不同的方法，如生物素链霉抗生素蛋白桥和亲和配体已被用于定向固定化。在这项研究中，我们用一定剂量的60CO 射线辐射了 PS 微量滴定板，并将这改性的板用于低分子量的 HIV1 重组抗原（分子量：32kDa）的吸附。我们通过在一个典型的间接 ELISA 测定系统中检测抗 HIV1 评估了辐射对PS 板的性能效果。此外，吸附/解析实验、AFM 和 XPS 被用来进一步研究蛋白质在 PS 表面的吸附。试验试验辐射处理辐射处理在 3 m3/min 的空气流速下，PS 96 孔微量滴定板（Nunc，丹麦）被60CO 源（福建农
4、业科学研究院，中国）在剂量率为 1 kGy/h 下，分别以 0、3、6、9、12、15 kGy 的水平进行辐射。ELISA 研究步骤研究步骤在辐射之后，用 pH 为 7.2，10 mL 的磷酸缓冲液（PBS）稀释HIV1 重组抗原（gp 120gp41，贾大勇博士友情提供） ，然后以100 uL/孔加入 ELISA 平板中，在 4 C 过夜（这个过程通常为包被） 。接着，用含 0.05%（v/v）的 Tween20 的 PBS 溶液洗涤板，并用封闭剂（含 2.5 mg/mL BSA 的 PBS）在 37 C 下封闭 2 h。在板的每个孔中加入 100 uL 稀释的血清样品（含有抗 HIV1 抗
5、体的阳性样品，来自全国临床检验中心，中国） 。在 37 C 下经过 0.5 h 的孵育后将板洗涤，然后加入适宜浓度的辣根过氧化物酶偶联羊抗人IgG（HRPIgG，Sigma，美国） ，接着再培养 0.5 h。各孔再次洗涤以除去任何未结合的轭合物，接着再加四甲基联苯胺（Sigma，美国）培养 15 min。加入 50 uL 的 2 mol/L 的硫酸终止比色反应，用 550 酶标仪（BioRad，美国）在 450 nm 处检测吸光值。所有实验重复 4次，以吸光值（OD450nm）的算术平均值计算。解析实验解析实验在每个包被孔中加入 100 uL 的 pH 为 7,100 mmol/L KNO3溶
6、液，在 37 C 下剧烈振动孵育 2 h。收集该溶液后，解析的 HIV1 抗原量由溶液中蛋白质浓度来确定。解析实验用 99 mmol/L KNO31 mmol/L HNO3溶液（pH 值为 3）和 90 mmol/L KNO310 mmol/L KOH 溶液（pH 值为 12）重复进行。使用微 BCA 蛋白检测试剂盒（Pierce，美国）测定蛋白质浓度。AFM 和和 XPS在封闭之前，包被板的孔底可用 AFM 和 XPS 测量。AFM 用的是接触式 Nanoscope a 型多模式扫描探针显微镜（数字化仪，美国）。XPS 测定是用 SSX100 分光仪（表面科学仪器，美国）结合单色化的 AlK
7、 X 射线源（能量为 1486.6 eV）在 150 W 条件下运行。结果与讨论结果与讨论免疫测定特性免疫测定特性各种剂量辐射的效果通过 ELISA 灵敏度进行评估。表 1 表明吸光度值随着辐射剂量的增加而逐渐增加，最大辐射剂量为 9 kGy，更大剂量的辐射会让吸光值降低到一定程度。与未处理组相比，经9 kGy 辐射的板在抗 HIV1 系列稀释液（446倍）中（图 1a）或包被浓度的一个宽的范围内（0.11000 ug/mL） （图 1b）都表现出25 倍更高的检测灵敏度。表 1 示出使用经 9 kGy 辐射过的板ELISA 的信噪比（信噪比，阳性样本吸光度的平均值与阴性样本吸光度的平均值的差
8、值除以阴性样本吸光度值得到的百分比）高达25.9，比控制组低 3 倍浓度的 HRPIgG 溶液仍然是可检测的。相反，使用未经处理板的 信噪比分析比较差，分别用 1:2400 和 1:800稀释 HRPIgG 时，只有 7.7 和 6.5。图 2 表示在 9 kGy 辐射板上的蛋白质吸附比未经处理的要吸附得更快并更早地达到平衡态。吸附吸附/解析行为解析行为为了确定是主要由于改型表面吸附能力的增加还是由于包被抗原更好的构象呈递提高了 ELISA 检测的灵敏度，已被包被抗原包被的未处理板和 9 kGy 辐射板与辣根过氧化物酶标记的兔抗 HIV1（兔多克隆抗体，通过将 HIV1 重组抗原注射到兔子里产
9、生）在一个直接的 ELISA 系统（这里名为吸附实验）反应。如果 ELISA灵敏度的提高主要是由于改性表面吸附能力的增加而不是包被抗原更好的构象呈递，使用辐射板的直接 ELISA 系统的吸光值应该会增减，因为多克隆抗体无论包被抗原有什么样的构象，都能识别它们。结果发现，吸附实验中所有包被浓度测定（8、40 和 200 ug/mL） ，使用 9 kGy 辐射板的直接 ELISA 的吸光值比未处理组的大 24 倍。从这个实验得到的结论和下文的 XPS 结果一致。抗抗 HIV1ELISA 测定系统中的测定系统中的 PS 表面表面通过解析实验评估了包被的稳定性。当包被浓度为 40 ug/mL 时，吸附
10、在经 9 kGy 辐射表面的 HIV1 抗原不能被 pH 为 7 的 100 mmol/L KNO3溶液或者 pH 为 12 的 90 mmol/L KNO310 mmol/L KOH 混合溶液去除。然而吸附在未经处理表面的 HIV1 抗原却能在同样条件下被去除 11%和 29%。在 pH 为 3 时，大约 6%/48%包被在经辐射过/未辐射过的板上的包被抗原被从 PS 表面去除。从其它包被浓度实验中获得类似结果。此外，结果发现，抗原在包被过程中通过共存的表面活性剂和盐几乎能不受干扰地吸附在改性表面，甚至加入 5%（v/v）Tween20 和 0.5 mol/L NaCl 后也没有观察到明显的
11、免疫反应性损失。这些结果表明，与未处理板相比，抗原优先吸附在辐射过的板上而且在很宽的 pH 范围内不易解析。表面表征表面表征为了探讨辐射板性能的改进，表面特性通过 AFM 和 XPS 进行检测。包被板的表面形貌通过 AFM 测定，示于图 3.HIV1 抗原表现为大约宽 0.1 um，高 0.05 um，平均间距 0.15 um 的聚合物。相比，改性后的表面，未处理板上的抗原分布是不均匀的，有些区域完全没有。这似乎是未处理板和经 9 kGy 辐射板的变异系数（CV，见表1）和 ELISA 检测灵敏度有所差异的主要原因。在蛋白质吸附前，在 PS 表面的 XPS 分析中只检测到碳和氧。未处理板含有
12、1.7%的氧（可能来自添加剂和灭菌处理） ，在用最佳辐射剂量 9 kGy 辐射后，含量上升到 13.1%，表明其中可能包括羟基、羰基、羧基等含氧基团的发展。因此，在辐射过程中表面氧化因亲水性也有相应的提高 ，所以可能是改性板性能提高的主要原因。在 HIV1 抗原包被后，固定在 PS 表面的蛋白质总量能通过 XPS检测到的 N 总量推断出（蛋白质的平均含氮量约为 16%） 。由图 4可看出，在所有包被浓度试验（1.61000 ug/mL）中，在经 9 kGy辐射过的板上吸附的蛋白质总量大约比未处理板上吸附的蛋白质总量多 1.53 倍。这和以上提到的 ELISA 结果一致，并表明经适当剂量60CO 辐射预处理的 PS 板确实表现出对包被蛋白更好的亲和力。结论结论低分子量的 HIV1 重组抗原能够被经 9 kGy（最佳剂量）的60CO 射线辐射预处理的 PS 表面直接吸附，而且所得到的包被复合物在 ELISA 检测中表现出高的灵敏度、特异性和同质化。吸附/解析实验的结果，AFM 和 XPS 分析表明亲水表面形成于辐射期间，对包被抗原展现出高的结合亲和力并且能更快速、更稳定地吸附蛋白质。本研究中用到的测定方法非常适合于 ELISA，并且也许能应用于其他使用 PS 作为载体基质的检测技术。
