医用电子显微技术

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1、 医用电子显微技术医用电子显微技术绪绪 论论 电镜室 陈明霞Tel: 82655158 E-mail: 电子显微镜以电子束代替光束，以电磁透镜（电子透镜）代替玻璃透镜而使物体成像的。（electron microscope, EM, 电镜） 分辨率能够分辨两点间最小距离的能力 人眼的分辨率：0.10.2mm 人眼的分辨率：0.10.2mm宏观水平 1665 年人类发明了光学显微镜，其分辨率：0.2m微观/细胞水平 1931 年德国科学家 Knoll 和 Ruska 发明了透射式电子显微镜，其分辨率：0.1-0.2nm （晶格）分子细胞水平/ 超微结构 1935 年 Knoll，1942 年 M

2、.Mullan(英国剑桥大学) 发明了扫描式电子显微镜，其分辨率：3- 6nm transmission electron microscope，TEM, 透射电镜 scanning electron microscope, SEM，扫描电镜电镜的应用电镜的应用 1 1、细胞生物学、细胞生物学 EM证实并丰富了细胞的微细结构LM：线粒体、高尔基体等EM：核糖体、微丝、微管等 细胞化学决定酶蛋白的特定部位，证实结构的机能状态 冰冻蚀刻生物膜结构真相单位膜液态相嵌学说2 2、分子生物学、遗传学、分子生物学、遗传学 分子生物学：借助 EM 观察细胞器的生物功能线粒体：氧化磷酸化全过程ATP 能源的产

3、生基粒内进行核蛋白体/核糖体（核酸+蛋白质）：核蛋白体/核糖体+信使核糖核酸（mRNA） 多聚核蛋白体/多聚核糖体电镜可见 （D=1-1.5nm） 遗传基因：DNA 分子链中某一区段可用特殊方法展开成一单链电镜可见3 3、微生物学、微生物学 1、进一步了解了细菌、真菌等形态结构 2、确定了病毒的形态 结构3、发现了病毒复制合成及制病机理 4、临床快速诊断病毒性疾病 4 4、免疫学、免疫学 在细胞超微结构水平上观察抗原抗体相互作用的部位，可解决 LM 难以定位的问题。如：不孕症、白血病的诊断：单抗 胶体金5 5、病理学、病理学/ /病理诊断学病理诊断学 （1） 病毒性疾病的诊断 （2） 肿瘤的诊

4、断 （3） 肾脏疾病的诊断 （4） 肝脏疾病的诊断 （5） 骨骼肌疾病的诊断 （6） 临床疑难病例的诊断（1 1） 病毒性疾病的诊断病毒性疾病的诊断 电镜是确定病毒形态结构最有效用的工具 超薄切片-感染细胞内病毒的大小、形态、排列及其复制组装、成熟的过程，有包膜病毒的 芽生成熟的部位、病毒包含体的形态特征、致病病毒的鉴定和分类 负染色快速、简单、诊断（2 2） 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 病理诊断：光镜+免疫组化大部分肿瘤可以明确诊断 病理诊断的局限性：肿瘤的多项分化+免疫组化试剂的交叉反应 电镜诊断：利用电镜技术进行超微结构诊断新途径神经内分泌肿瘤 神经内分泌颗粒（原发/转移） 电镜识别 （3 3

5、） 肾脏疾病的诊断肾脏疾病的诊断 诊断：光镜+免疫荧光+电镜，在某些疾病的诊断中，电镜起着决定性作用。遗传性肾炎基底膜分裂、板层肾小球薄基底膜病基底膜变薄Farbry 氏病足细胞中大量的髓鞘样小体肾淀粉样变类淀粉样纤维纤维性肾小球病微管样纤维（4 4） 肝脏疾病的诊断肝脏疾病的诊断 代谢性疾病的诊断（肝穿刺）Wilson 病 病变早期线粒体大小、 形态不一；基质电子密度增高；内外膜分离等（5 5） 骨骼肌疾病的诊断骨骼肌疾病的诊断 代谢性肌病：线粒体肌病骨骼肌内含有大量的线粒体糖原储积病骨骼肌纤维间含有大量糖原 （6 6） 临床疑难病例的诊断临床疑难病例的诊断利用多种电镜技术 对临床（LM）难

6、以确诊的病例进行诊断 急性白血病：细胞具有高异质性+形态学特征诊断 60%-70%（LM） WBC 分化成熟过程中相应的细胞表面抗原 免疫电镜技术+EM 酶细胞化学+形态特征 诊断（EM） 贫血：RBC 的形态学改变（SEM6 6、 其它其它 理工科：各种材料的微细结构 植物类：花草、树叶等电镜对临床疾病的诊断作用是效的，目前仍存在以下问题电镜对临床疾病的诊断作用是效的，目前仍存在以下问题 ： 1、 传统习惯问题 2、 免疫组化技术及分子遗传学技术的快速发展可辅助诊断 3、 EM 技术的复杂性，样品制作的高难度，仪器设备昂贵 4、 诊断与鉴别诊断的指标尚未完全确立EMEM 下进行观察时应具有以

7、下观点：下进行观察时应具有以下观点： 1、 形态与功能 2、 全局与发展 3、 比较和对照 4、 三维立体 5、 LM 和 EM电镜图象的描述电镜图象的描述 形态，大小，数量，电子密度“大部分线粒体的基质内近嵴旁可见少数 150-300nm 大小，无定形，絮状，中等电 子密度的物质沉积”可以说明该线粒体以至于该细胞已处于不可逆的严重退变状态。 如何获得理想的电镜照片如何获得理想的电镜照片 1、 首先要排除各种人工假象（取材、固切片、染色） 2、 EM 操作正确，排除漂移、像散等因素。 3、 观察中拍照注意定位准确，调整好反差及焦距。 4、 暗室制作、照片洗印。 细胞及细胞器大小的计算方法细胞及

8、细胞器大小的计算方法图象的大小（mm）1000（）1000 (n)该图片的放大倍数 = 某细胞/细胞器的实际大小(nm)照片的标识方法照片的标识方法 标尺大小（mm）1000()1000(n) 该图片的放大倍数= 标尺代表的实际大小(nm)电子显微镜的基本原理与结构电子显微镜的基本原理与结构分辨率能够分辨两点间最小距离的能力 透射电镜（内部结构） transmission electron microscope TEM 扫描电镜（表面结构） scanning electron microscope SEM，1 1、透射式电子显微镜（、透射式电子显微镜（TEMTEM）基本原理）基本原理 分辨本领

9、/分辨率： 能够区别物体细节的能力/ 放大倍率： 物体经放大后的大小与原物大小之比影响人眼分辨率的主要因素：照明、距离、反差(人眼的分辨率=0.1-0.2mm)影响光镜分辨率的主要因素：色差、球差、干涉、衍射 ( LM 的分辨率=0.2m) 阿贝公式 0.61= nsin =分辨率 =光线的波长(390-750nm) n =物体所在介质的折射率 =物与物镜所成夹角一半 目前技术上 nsin 最大可达 1.2，则 LM 的分辨本领：0.5电子显微镜光源电子波 A.具有光线的粒子性质和波动性质，波长极短 B.波长与其速度成反比 ，加速电压增加波长变短加速电压 电子波长 100V 1.23 50KV

10、 0.053 100KV 0.037 1mm10 7放大倍数与分辨率的关系放大倍数与分辨率的关系 M=M= 眼眼/ / 镜镜 M放大倍数 眼人眼的分辨率 镜电镜(LM)的分辨率 有效放大：有效放大：显微镜的分辨本领放大到人眼的分辨本领所需要的最小放大倍数 (LM=500-1000,EM=1000,000) 无效放大无效放大/ /空放大：空放大：超过有效放大值的放大 0.2mm(人眼) 0.2m （LM） 0.2nm（EM）2 2、TEMTEM 的结构的结构光源电子枪 电子透镜静电透镜（电场）电磁透镜（磁场） 样品室 萤光屏和照相机 真空泵（ 旋转泵/机械泵和扩散泵联合抽气) 其它部件：阀门，真

11、空管道，各种密封圈垫 真空不好：灯丝氧化、高压放电、电子散射、样品污染 镜体系统稳定的电压、电流，电子枪用的高压电源： 3 万伏；10 万伏；20 万伏；50 万伏；100 万伏；300 万伏。3 3、TEMTEM 的成像机制的成像机制 光学显微镜物体对光线的吸收和反射 电子显微镜物体对光源电子的散射。 组成物体元素的原子序数愈大则对电子的散射能力愈强，原子序数愈小则对电子的散射能力愈 弱。4 4、TEMTEM 的用途的用途 样品的内部结构5 5、 SEMSEM 结构与基本原理结构与基本原理 原理 二次电子成像结构电子光学系统 （镜体系统） 电子枪（光源） 、电子透镜、样品室信号检测、传递和显

12、示系统扫描系统真空系统 电子系统： （同 TEM） 6 6、SEMSEM 的成像机制的成像机制加速电压 电磁透镜阴极电子 电子束（电子探针） 聚焦 探测器 二次电子发射 样品 表面 视频放大器 二次电子信号 信号反差 显像管 7 7、SEMSEM 特点特点 ：分辨率较高（LM）：放大倍数大且方便（100，000-200，000）：景深长，视场大 （1MM/TEM，10CM）：样品制备简单/原样（TEM）：对样品损伤小：可带出多种探测器，对样品进行综合分析：可对图像录制，可用计算机进行图像处理TEM：内部结构（高分辨率）SEM：表面结构 8、SEM 的用途 样品的表面结构影响电子显微镜分辨率的主

13、要因素影响电子显微镜分辨率的主要因素 1. 仪器质量 2. 电源 3. 振动和磁场 4. 环境污染 5. 环境的温湿度 6. 操作 超高压电子显微镜：电压 5003000KV 分析电子显微镜 高分辨型 TEM/SEM：采用场发射、超高真空、低球差、高加速电压等技术，DNA/RNA 环境 SEM：采用多级压差光阑，使镜筒保持高真空的同时，样品室可保持一定的大气压，为含 水量大的生物样品及湿样品准备了环境条件。 扫描探针显微镜：扫描隧道显微镜、原子力显微镜电子显微镜样品制备技术电子显微镜样品制备技术透射电镜样品的制备技术透射电镜样品的制备技术 扫描电镜样品的制备技术扫描电镜样品的制备技术超薄切片技

14、术 生物材料制作冷冻蚀刻技术 非生物材料制作负染色技术 血管铸型其它超薄切片技术超薄切片技术: :常 规 电 镜 技 术 电镜酶细胞化学技术 在一定的条件下使细胞内的酶作用于酶的底物，再将酶反应的产物 作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在电镜下具有可见性电镜免疫细胞化学技术根据抗原抗体特异性结合的原理， 用高电子密度的标记物标记抗 体后，和相应的抗原结合，用电镜观察的一种技术 电镜放射自显影技术 利用放射性同位素所发射出来的带电粒子作用于感光材料的卤化 银晶体，从而产生潜影，通过显影过程将 “像”显示出来，以研究该放 射形物质在机体，组织或细胞的经迹或颗粒定位技术 示踪细胞化学技术 利用高电子密度示踪剂在细胞内的扩散，通过电镜下观察的一种 技术冷冻蚀刻技术（复型）：冷冻断裂于复型相结合的一种技术主要显示膜相结构的技术负染色技术负染色技术原理：利用染色液(重金属盐类)中的高电子密度物质