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1、细胞试验TNF-细胞毒性体外中和实验1 培养 L929 细胞2 待细胞铺满培养瓶底80%时，弃去培养基，用胰蛋白酶/EDTA 在37消化细胞 2min。计算细胞数量，分装至 96 孔培养板中，每孔约 2 104细胞，加入 0.1ml1640 培养基， 37、5%CO2培养过夜。3 在另一 96 孔板中设置如下实验组：A 组：将 0.05ng TNF-与倍比稀释的纯化单抗 (0-100g/ml) 混合。 B 组：将 0.05ng TNF-与倍比稀释的抗 TNF-单抗(0-100g/ml) 混合。 C 组：含有倍比稀释的纯化单抗(0-100g/ml) 。P 组：只含有 0.05 ng TNF- 。
2、组：只有 1640 培养基。 各组加入 200l 1640 培养基和终浓度 1g/ml的放线菌素 D， 37、5%CO2 孵育 2h。每组设置 3 个复孔。4 弃去细胞培养孔内的培养基， 将上述混合物加至孔内， 37、 5%CO2 培养 24 h。5 在孔内加入 10l MTT显色液，继续培养6h 后，弃去培养液，加入100l DMSO 终止反应并溶解蓝色结晶， 用 PBS调零，测定 A570 值。6细胞毒性按如下公式计算：细胞毒性(%)=100-A570(A,B,P)/A570N100%；细胞毒中和率按如下公式计算：细胞毒中和率 (%)=100-(细胞毒性 (A,B)/ 细胞毒性 P) 10
3、0%。7 半数抑制浓度 (IC50)是能够中和一半TNF-细胞毒作用时的scFv浓度。参考文献山西医科大学博士毕业论文 利用噬菌体表面展示技术制备抗人肿瘤坏死因子 单链抗体及其人源化改造2004 类风湿关节炎动物造模方法佐剂性关节炎 (adjuvant arthritis，AA)模型1 材料1.1 实验动物选用 Wistar 大鼠 50 只，雄性，清洁级，周龄 8-12周，体重 140160g 2 方法2.1 分组将 50 只雄性 Wistar 大鼠采用数字表法随机分为5 组， 分别编号组，每组10 只。组为正常对照组，组为单纯造模组(AA+NS) ，组为造模 +甲氨喋呤组 (AA+MTX),
4、 组为造模 +益赛普低剂量组 (0.44mgkg)，组为造模 +益赛普高剂量组 (0.88 mgkg)。全部大鼠于层流架中饲养，适应性喂养一周。2.2 大鼠 AA 模型的建立2.2.1 在完全弗氏佐剂中加入卡介苗，用20ml 注射器、 8 号针头反复抽吸，充分乳化，将其配置为10 mgml 浓度(原 CFA 中卡介苗浓度为 1 mgml)的水包油乳剂。2.2.2 造模实验第一天在第、组大鼠的尾根部皮下注射该乳剂 0.2ml 致炎。诱发佐剂性关节炎，而正常对照组大鼠的尾根部皮下注射等量生理盐水。2.3 给药于致炎后第12 天至第 23 天、组皮下注射益赛普，组予以益赛普 0.44mgkg.d，组
5、予以益赛普 0.88mgkg.d。给药容积均为 0.1ml/100g 体重。连续 12 天。组大鼠给予甲氨喋呤2.7mgkg.w 灌胃，组大鼠蒸馏水灌胃0.5ml/只.d；给药时间均固定在每天上午 9：00。2.4 一般状态的观察及关节肿胀度的评定观察各组大鼠的体重、饮食及活动状态的变化，体毛色泽改变，关节红肿情况，与实验的第0d，3d，6d，9d，12d，15d，18d，21d，24d，27d 用排水法测右足体积，分别测量3 次，取平均值，并根据关节红肿程度进行AI 的评定。2.5 血浆 TNF-检测血浆 TNF-浓度的检测采用双抗体夹心ELISA 试剂盒。2.6 滑膜组织 TNF-表达滑膜
6、组织标本切片免疫组织化学染色。2.7 AA 大鼠滑膜组织病理学观察2.8 统计学方法所有数据以 xs 表示，应用 SPSS13.0统计软件做统计分析，采用单因素方差分析，相关性用直线相关分析。以P0.05 作为具有统计学意义的判定标准。参考文献河北医科大学硕士毕业论文 肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白对大鼠佐剂性关节炎及血清与滑膜中TNF-、 HIF-1和 VEGF 表达的影响2008 克罗恩氏病动物造模方法三硝基苯磺酸法炎性肠病 (infammatory bowel disease ， IBD) 是一类严重影响人们生活质量的慢性疾病，根据其病理特征可分为克罗恩氏病(Crohns disease，
7、 CD) 和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis ，UC)1 。三硝基苯磺酸(TNBS) 诱导的结肠炎模型，是研究 IBD 最常用的鼠类模型之一。模型最早由 Morris 等 14于 1989 年在大鼠上建立，而后又于1995 年在小鼠 15 上成功诱导。模型以直肠给药的方式，将 TNBS 与酒精的混合物灌入动物结肠中诱导炎症。其中酒精用来破坏肠黏膜屏障，从而使TNBS 能够进入肠壁，并与肠道细菌和机体自身蛋白作用形成抗原，诱导免疫致敏反应。模型建立后，实验动物会出现精神萎靡、体重减轻、腹泻、便血、肠壁增厚等症状。其免疫反应以TH1 型反应为主，表现为细胞因子如肿瘤抑制因子 (T
8、NF- )、干扰素 (IFN -)、白介素12 (IL-12) 等分泌水平上调16 试剂：TNBS 致敏液 : 浓度为 1 mol/L 的 TNBS (Sigma 公司 )水溶液、水、无水乙醇按体积比3.5: 11.5: 15 混合，制成含 3.5%TNBS 的 50%酒精溶液 ; 麻醉剂 : 戊巴比妥钠 (Sigma 公司 )按照质量体积比配成1%溶液 ; 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution ， PBS); 10%中性甲醛固定液 ; 便隐血检测试纸(珠海贝索生物技术有限公司); 小鼠灌肠 (胃)针头及100 l 微量注射器 (上海玻利鸽工贸有限公司)。肠炎诱导操
9、作：戊巴比妥钠按照体重0.01 ml/g ， 腹腔注射麻醉小鼠。用连有灌肠针的微量注射器抽取TNBS 致敏液 60 l， 小心的将针头探入小鼠肛门内，深至34 cm，过程中避免碰伤肠壁，缓缓推入药液。对照组给予相同体积的50%酒精溶液，灌肠完毕后缓慢拔出针头。为确保致敏液与肠道充分作用，将小鼠头朝下，固定在一个45o角倾斜的平面上，静置 30 min。间隔 1 h 后， 再进行一次同样的给药操作。小鼠苏醒后，将小鼠放回笼中。另外建模的方式还有恶唑酮肠炎模型，选用雄性20 - 25 g S JL/ J 小鼠 (6 - 8 周龄 )予乙醚一过性麻醉后， 经肛门插管深入距肛缘4 cm 处 ， 缓慢注
10、入恶唑酮150 L (6 mg溶于 50 %乙醇中 ) ，为确保注入的恶唑酮在结肠内弥散分布，可将小鼠尾巴提起持续倒置30 s。3 d 后处死可见结肠产生UC 的病理改变，组织学特征和分布与人类UC 类似。结肠炎动物模型研究证实依那西普与英夫利昔抑制肠上皮细胞凋亡的能力相当Fries W, et al. Int J Med Sci. 2008;5:169-80. 目前认为上皮细胞屏障丧失完整性是克罗恩病(CD)发病制中的第一步，肠上皮细胞的凋亡率是肠粘膜屏障功能的决定因素之一。TNF-alpha 作为克罗恩病的主要促炎介质之一，是启动肠上皮细胞凋亡程序的外部信号。本研究目的是要弄清楚实验性结肠
11、炎对肠上皮细胞凋亡的影响，以及两种TNF 拮抗剂(英夫利昔和依那西普)的治疗作用。另外还要检验TNFR1(-/-) 小鼠中 TNFR1 的重要性。结果显示，给药3 小时以及6 小时后，英夫利昔和依那西普均可有效降低游离型TNF-alpha 水平 (与基线相比，两种处理均达统计学显著意义，p0.01)。用 TUNEL 染色以及免疫组化检测FasL、Bax 的表达水平来评估回肠肠上皮细胞凋亡，结果提示动物模型肠上皮细胞凋亡率在肠炎诱导剂处理后第3、第 6 小时上升。 TNF 拮抗剂治疗组以及TNFR1(-/-)动物却没有这些现象。抗凋亡的Bcl-2 在安慰剂对照组回肠上皮细胞有表达，而在DNB 诱导肠炎组的表达受到抑制。Bcl-2 在 TNF 拮抗剂治疗组以及TNFR1(-/-) 动物的表达也是正常的。DNB 诱导的结肠炎在极早期就出现凋亡率增加。两种TNF 拮抗剂，依那西普和英夫利昔，在抑制肠上皮细胞凋亡方面功效相当，其最可能的机制是通过灭活游离型TNF-alpha 。
