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1、硕士学位论文中文摘要凋亡抑制基因L i v i n 在肝癌中的表达及其与B c l 2表达相关性研究摘要【目的】研究凋亡抑制基因L i v i n 在人原发性肝癌组织中的表达及其与生物学特性的关系；凋亡抑制蛋白L i v i n 与B c l 2 蛋白在肝癌中表达的相关性；凋亡抑制蛋白L i v i n 与肝癌细胞中凋亡增殖的关系。【方法】R T P C R 检测肝癌组织、癌旁正常组织L i v i n 基因表达；W e s t e r n 印迹杂交检测肝癌组织、癌旁正常组织L i v i n 蛋白表达；免疫组织化学法检测L i v i n 及B c l 2 蛋白表达；流式细胞术检测肝癌细胞的
2、增殖活性及凋亡水平。【结果】1 、L i v i n 基因在5 4 例肝癌组织中表达阳性率为8 5 2 ( 4 6 5 4 ) ，而在2 7 例癌旁正常肝组织中低表达，阳性率为3 7 1 ( 1 2 7 )两者之间差异显著( P O 0 5 ) ，与肝癌是否发生转移有关，提示其可能成为原发性肝癌特异性诊断及预后不良的一个重要监测指标和肝癌基因治疗的一个新靶点。2 、免疫组织化学法结果显示，L i v i n 蛋白在5 4 例肝癌组织中表达阳性率为8 7 1 ( 4 7 5 4 ) ，在2 7 例癌旁正常肝组织中硕士学位论文中文摘要低表达，阳性率为7 4 1 ( 2 2 7 ) 两者之间差异显著
3、( P O 0 5 ) T h ee x p r e s s i o no fL i v i ng e n ew a sl硕士学位论文英文摘簧c l o s e l yr e l a t e dt ot h et r a n s f e ro fh e p a t o c a r c i n o m a 僻 0 0 5 ) ，而与肝癌是否发生转移有关。在肝癌和癌旁止常组织均见G A P D H 蛋白表达( 表3 ，图2 ) 。表3L i v i n 蛋白在肝癌中的表达与生物学特性的关系硕。f ：学位论文第一章G A P D HNNNTTTT鬻黼镧黼鳓骖猢鳓燃一绷嘲鞠心_ _ 鞠黟獭一猢簟缈图2
4、W e s t e r nB l o t 检测肝癌组织，癌旁正常组织肝组织 L i v i n 蛋白及G A P D H 表达情况1 3 讨论细胞凋亡是调节机体平衡的重要机制，生理状态下凋亡途径可清除体内衰老和异常的细胞，保持体内组织的动态平衡H ，63 。目前，国内外对肿瘤的研究较多，普遍认为，肿瘤的发生原因虽然尚不完全清楚，但许多研究表明，肿瘤的发生不仅与细胞的增殖和分化异常有关，与细胞的凋亡失衡也有密切的关系，受细胞内外多种因素控制。因此，研究细胞凋亡在肿瘤发生、发展中的作用，对于弄清肿瘤的发病机制及探索肿瘤新的治疗方法具有重要的意义。凋亡抑制蛋( i n h i b i t o ro
5、f a p o t o s i sp o r t e i n ，I A P ) 是一类内源性细胞抑制因子，是首先由C r o o k 吃1 等于1 9 9 3 年在杆状病毒C p G V 和O P M N P V 中发现并分离出来的一类新的独立于B c l 2 的抗凋亡蛋白。目前人类己发现8 种I A p s ：C I A p I ( H I A p l ) 、c l A P Z ( H I A P Z ) 、N I A P ，X I A P ( I L P I ) 、I L P Z 、S u r v i v i n 、B r u c e及新成员L i v i n ( 又称M L I A P
6、和K I A P ) H 2 _ 1 6 1 。它在很多物种起抑制凋亡的作用，其过度表达引起的凋亡不足与肿瘤的发生有密切的关系。与其他凋亡抑制蛋白如p 3 5 或者C r m A 比较，I A P s 有着更广泛的抗凋亡作用。I A P s 主要通过抑制C a s p a s e蛋白的活性，参与肿瘤坏死因子( T N F ) 介导的信号转导，与核因子K B 相互作用硕士学位论文第一章发挥抗细胞凋亡作用。除此之外，I A P s 还参与细胞周期的调控，调控多种信号的转导。l A P s 家族结构功能相似，通常包含2 3 个串联的含有半胱氨酸组胺酸( C y s H i s ) 的杆状病毒I A
7、P 重复序歹I J ( B I R 结构) 和一个锌指结构( m N G ) ，其B I R结构是其发挥功能的主要单位。l A P s 家族的组织分布差异很大，在肿瘤组织中常出现I A P $ 的过度表达，尤其是S u r v i v i n 和L i v i n 的分布具有肿瘤组织特异性。L i v i n 蛋白是近年来发现的人类l A P s 家族的新成员，最初从人类胚肾e D N A克隆得到，称为K I A P ( k i d n e yi n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ) 。由于该基因在黑色素瘤细胞中高度表达，也叫做
8、M L I A P ( m e l a n o m ai i h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n ) 陷 。与其它成员一样，L i v i n 含有高度保守的约7 0 a a 的B I R ( b a c u l ov i r a lI A P R e p e a t ) 结构域( 结合和抑制死亡蛋白酶的关键部位) 和梭基末端环指结构( R I N G ) ，其高级结构与S u r v i v i n 很相似。L i v i n 在正常成人的大多数终末分化组织中( 除胎盘) 均低表达或不表达，表皮、淋巴、脾脏和黑色素细胞表达很低。在胎
9、儿发育过程中多种组织高表达，如胎儿的脑、胸腺、肾和肝聃 。研究表明，L i v i n 在多数肿瘤中高表达，如黑色素瘤、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、膀胱癌、胃癌、前列腺癌、白血病、肺癌以及淋巴瘤等o 一1 3 1 。有关肝癌组织L i v i n 蛋白表达情况以及其与肝癌临床特征之间关系的报道比较少见。此外，L i v i n 存在两种异构体( L i v i n a 和L i v i n p ，前者e D N A 全长8 9 7 b p ，编码2 9 8 a 蛋白，约3 3 k D ；后者e D N A 全长8 4 3 b P ，编码2 8 0 a 蛋白，约3 0 k D 。分别含有1 3 5
10、1 和1 2 9 7 碱基，两者除相差一段5 4 个碱基以外，其他完全一致，在功能上没有本质的差别n 钔。L i v i n 蛋白基因定位于细胞内微丝结构和细胞核，在高表达L i v i n 的M C F 7 乳腺癌细胞系中，L i v i n C 末 端的刚G 结构与细胞内微丝结构结合，从而定位在细胞骨架。L i v i n 蛋白主要在细胞质中，不定位在纺锤体上n 钉。C a s p a s e s 蛋白是介导细胞凋亡的重要蛋白家族，大多数刺激物是通过C a s p a s e s 蛋白的级联激活反应引起细胞凋亡的。L i v i n蛋白通过其B I R 结构域能与C a s p a s e
11、 s 蛋白多个成员相互作用，尤其是C a s p a s e s 3 ，阻止C a s p a s e s 蛋白在细胞凋亡时执行蛋白切除功能，从而起到抑制凋亡的作用。基于L i v i n 的抗凋亡功能和独特分布，提示L i v i n 蛋白与肿瘤发生、发展之间可能存在密切的联系，对于这种联系相关性的探讨成为人们关注的热点。本研究通过采用免疫组织化学技术和W e s t e r nB l o t 技术检测肝癌组织及癌旁正常组织。结果表明，L i v i n 蛋白在原发性肝癌组织中的表达率及表达强度均较癌旁正常肝组织高，差别分别有统计学意义。提示L i v i n 蛋白的表达可能在肝癌的发生、发
12、展中具有重要的作用。L i v i n 蛋白的表达与肝癌的发病年龄、患者性1 2硕士学位论文第一章别、肿瘤的大小及分化程度等无统计学差异；与肿瘤是否发生转移有统计学差异，即己发生转移者较未发生转移者的表达率高，这说明L i v i n 蛋白的表达与肝癌的生物学行为密切相关。L i v i n 蛋白的表达与肝癌的预后之间的关系有待进一步研究。目前，原发性肝癌发现晚，预后差，死亡率高，严重威胁着人类的健康，治疗仍以手术治疗方法为主。虽然综合治疗己取得了较好效果，其5 年生存率仍有待进一步提高。人们期待着在基因、分子水平取得突破性进展。有研究表明，L i v i n 蛋白不仅在肿瘤组织中高表达，而且
13、其高表达在肿瘤放疗、化疗时机体耐药过程中起着重要的作用，是肿瘤患者耐药的机制之一n 们。如果抑制L i v i n 蛋白的表达，诱导肿瘤细胞发生凋亡，将在逆转肿瘤耐药方面起到重要作用。本结果显示L i v i n 蛋白在肝癌中高度表达，这就为我们在肝癌的治疗过程中寻找肝癌生物治疗的靶点，联合手术与其他治疗，而提高肝癌的治疗效果，并为减少肿瘤转移和复发起重要作用。L i v i n 基因高表达的肿瘤凋亡阈值升高，同时还与肿瘤耐药性和放射治疗敏感性有关3 一钉。因此，检测肝癌组织l i v i n 的表达，不仅为判断肝癌的生物学特性提供了重要依据，亦对肝癌的基因治疗提供新的靶点，具有重要的基础研究
14、和临床指导意义。我们对L i v i n 蛋白在原发性肝癌中的表达水平，以及与某些临床资料之间的关系进行了探讨。希望为原发性肝癌的预后监测、生物治疗和基因药物的开发提供一个新的思路。1 4 结论1 4 1L i v i nm R N A 和L i v i n 蛋白在肝癌组织中异常高表达，显著高于癌旁正常肝组织中，且两种异构体基本同时表达，表明L i v i n 蛋白的表达与原发性肝癌的发生、发展有关。1 4 2L i v i n 蛋白的表达与肝癌的发病年龄、患者性别、瘤的大小及肝癌的分化程度均无统计学差异；而与肝癌是否发生转移有关。提示L i v i n 蛋白的表达与肝癌的预后有关，可能成为原
15、发性肝癌预后不良的一个重要的监测指标和肝癌生物学治疗的一个新靶点。硕士学位论文第二章第二章凋亡抑制蛋白L i v i n 与B c l 2 相关性的研究，工J -翮f 雷L i v i n 是L A P 家族中的新成员，特异性表达于入的胚胎组织及大多数人类实体瘤细胞，在正常成人组织中低或无表达，提示该基因可能在肿瘤的发生和发展中起着重要作用7 8 9 。B c l 2 是一种凋亡相关基因，与肿瘤的发生发展关系密切眩。肝癌是常见的恶性肿瘤之一，目前研究表明多种凋亡相关基因参与肝癌的发生、发展，但L i v i n 在肝癌中的表达及与B c l 2 表达相关性的研究至今国内外未见报道。本试验通过检
16、测L i v i n , B e l 2 蛋白在肝癌组织和癌旁正常肝组织中的表达，旨在探讨L i v i n 和B c l 2 癌基因在肝癌发生，发展的关系。2 1 实验材料与方法2 1 1 实验材料2 1 1 1 病例资料及组织标本免疫组织化学法检测的5 4 例肝癌组织及2 7 例相应的癌旁肝组织与R T P C R 实验部分的标本相同。2 1 1 2 主要试剂药品( 1 ) S - P 试剂盒( 北京中杉产品) ( 2 ) 一抗L i v i n 兔抗人多克隆抗体( 美国A b e o m 公司产品) ，工作浓度1 ：5 0 0 ( 4 ) 一抗B c l - 2 鼠抗人单克隆抗体( 北京中杉公司产品) 。( 5 ) 显色剂为3 ，3 一二氨基联苯胺( D A n ) 溶液( 北京中杉公司产品) 。2 1 1 3 主要仪器设备( 1 ) B i m g t 5 04 0 石蜡标本切片机( 英国) 。( 2 ) O l y m p u s - B
