《CTAB提取基因组,步骤及注意事项》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CTAB提取基因组,步骤及注意事项（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、蛋白酶 K的配制常用浓度（ 20mg/ml ） ：称取 20mg 蛋白酶 K，溶于 1ml 灭菌去离子水中。轻摇直至溶解。Rnase A 配制常用浓度（ 10mg/ml ） ：称取 10mg Rnase A,溶于 1ml 灭菌去离子水中。100煮沸 15min，冷却至室温。 -20保存。因为移液枪量程限制，本实验配置2mg/ml 的溶液， 即称取 10mg Rnase A ，溶于 5 ml 灭菌去离子水中。 100煮沸 15min，冷却至室温。-20保存。* 提取之前准备：CTAB提前 65预热 ,蛋白酶K配好 ,37水浴锅开启，37预热SDS溶液，异丙醇 -20预冷，无水乙醇-20预冷1.取
2、生长 3 天的菌液25ml 加入到灭过菌的40ml 离心管中， 绿菌、 白菌各两管， 5000rpm离心 20min，弃上清3 天的菌液较好。 4 天的菌液提取的DNA 较多， 但是步骤 7 及后面的步骤中上清均有黄色出现2.分别混合两管绿菌和白菌，加入 9.5ml TE缓冲液悬浮沉淀， 并加入0.5 ml 10% SDS ， 100ul 20mg/ml 的蛋白酶K，混匀， 37水浴 1h。水浴过程中轻缓颠倒离心管。混合时可以先将菌渣混合再加入TE重悬，也可以先将TE加入到一管， 吹打重悬后再全部加入另一管吹打重悬。本步骤的目的是是使细胞破碎，因为菌液比较粘稠，水浴过程中颠倒有助于使细菌与酶及
3、 SDS充分接触， SDS有裂解细胞膜的作用蛋白酶 K消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA 从核蛋白中游离出来。3.加入 1.5 ml 5M 的 NaCl，混匀4.加 1.5 ml CTAB/NaCl溶液，混匀， 65水浴3040min，每 10min 轻缓颠倒离心管数次。 期间配制酚 -氯仿 -异戊醇（ V:V:V=25： 24： 1）约 40ml。高离子强度的溶液中(1.4mol/L NaCl)， CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而 DNA溶解于液相中轻缓颠倒有助于反应液充分接触5.以后操作要尽可能轻缓，不要剧烈震动6.冰上孵育10min 直至离心管内液体冷却此步目的是
4、为了防止温度过高以至于后面加入的酚立刻被氧化掉7.加入等体积（约15ml）酚 -氯仿 -异戊醇，轻轻摇晃，5000rpm 离心 20min，将上清移至 干净 50ml 离心管酚是强烈的蛋白质变性剂，能有效使蛋白质变性而除去氯仿有强烈的脂溶性，去除脂类杂质，氯仿有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚离心后有机溶剂在试管底层(有机相 )，DNA 存在于上层水相中（上层水相可能会有颜色） ，蛋白质则沉淀于两相之间。吸取上清时千万不要吸到蛋白质层，宁可放弃部分水相异戊醇是表面活性剂，可起到消泡作用（SDS易产生大量泡沫）5ml 的枪头装上去的时候可能要用到两个手，那么一定要注意手不能碰到枪头部分
5、8.加入等体积氯仿-异戊醇，轻轻摇晃，静置直至分层，取上清移至干净50ml 离心管移液时同样注意不要将非水相部分吸取了9.加等体积 -20预冷的异丙醇， 颠倒混匀， -20下静置30min， 直至析出沉淀， 最好 -20 过夜。异丙醇的作用是使DNA 析出，静止时间越长析出的量越多。10.5000rpm 离心10min，沉淀DNA，弃上清。用70% 乙醇漂洗两次，倒置在洁净的滤纸上吸干11.加入 1ml TE ，并用去掉尖头的1ml 枪头轻轻吹打，转移至灭过菌的10ml离心管。用去掉尖头的枪头是为了减少DNA 的断裂转移至 10ml 的离心管是为了减少后面步骤的损失。取离心管时一定要用镊子，镊
6、子现在酒精灯上烧一下，凉了之后夹取离心管。12.加入 25ul 2mg/ml 的 Rnase A（共 50ug） ， 37水浴30min，水浴完成后冰浴使反应液降温。 取等体积酚 -氯仿 -异戊醇抽提， 5000rpm 离心 10min，将上清移至洁净的10ml EP管中冰浴原因同前，移取上清时同样注意不要扰动下层13.加 1/10 体积 3M 的 NaAc ，及 2 倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒混匀沉淀DNA。 -20静置 2030min 或更长，直至DNA 沉淀形成白色絮状物预冷的目的是降低DNA 的溶解度加入 NaAc 是为了提供单价的阳离子，Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少DNA
7、分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀14.用灭过菌的折成勾状的1ml 枪头勾出 DNA 沉淀， 转入新的10ml 离心管。 70%乙醇漂洗 两次，在吸水纸上吸干。勾状枪头的做法：首先装上枪头， 选取镊子中部加热一下，待稍冷不至于将枪头烫坏的时候，将枪头慢慢靠近酒精灯至适当的位置，用镊子夹住枪头轻轻往一边折。冷却变形。枪头变形60就可以了，但在操作的过程中不要把枪头烫坏了。如果 DNA 的量很少，也可选择1.5ml 的离心管，但一定要确保70%的酒精能够漂洗充分吸水纸上吸干一般很难做到，因为DNA 絮状物位多孔物，里面结合了很多水，吸 水纸不能进去吸。只能在超净台上等他慢慢吹干，时间较长15.溶于 1mlTE溶液。 -20保存看具体要求需不需要溶于TE中。
