流式的工作原理

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1、Becton Dickinson Immunocytometry System - 1 - 第 1 章 仪器结构和原理流式细胞技术是一种定量分析技术。定量测量在细胞生物学中之所以重要，是因为要想鉴别出一个细胞群体，主要是依据细胞特殊标记物的数量，而不仅是依据标记物的存在与否。多参数相关分析可以对细胞固有的性质，例如光散射的测量与定量测定细胞的特征如表面受体、和DNA同时进行。当然，必要时还可同时再测定胞浆内抗原、核内抗原等等。这样，就有可能从一个复杂的细胞混合体中，识别出某一个特定的细胞亚群。由于只有对大量的细胞进行测量才能发现稀有的亚群并把它分选出来，所以快速测量是必需的。这里所谓分选即流式

2、细胞分选术，是根据所测定的各种细胞性质的不同组合，从细胞群体中将某个亚群分选出来，以对它进行功能研究、形态学研究、进一步培养或做其它的分析。本公司是生产流式细胞仪的主要厂家，我们生产了一系列台式和落地型的流式细胞仪，并研发生产了 FCM 所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。台式机（FACScan、FACSort 、 FACSCalibur等）易于操作，稳定性好，分析速度快，适合在临床实验室中应用。落地型机器(如 FACSAria 、FACSVantage SE、FACSVantage Diva 等) 具有快速分选功能，功能齐全，分析灵活，适合基础科学与生物医学研究。我们此次主要介绍台式机的结构及其

3、工作原理。2.1 流式细胞仪的工作原理流式细胞仪一般都包括液流系统、光学系统和电子系统，某些机型还可选配分选系统。待测样本中的细胞经液流系统传送依序地通过流式细胞仪中激光照射的区域，细胞受激光的激发产生信号，被信号接收器接受并放大，这些放大了的信号经计算机分析处理，并以图表的形式直观地显示出来；通过分选系统还可以将某些类型的细胞群体筛选出来。流式细胞仪产生并分析的信号主要有光散射信号和荧光信号。光散射信号的强弱可以反映细胞的大小、形态及胞浆颗粒化的程度等。依荧光素的不同，用不同波长的光激发，发射出不同波长的荧光，可显示不同的颜色，在不同的实验体系中，这些荧光信号就可以反映不同的细胞生物学特性。

4、将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的平衡缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过激光照射区(液柱与入射的激光束垂直相交点称为检测区)，被荧光染色的细胞受强烈的激光照射后发出各色荧光，同时产生光散射。荧光信号由与激光束垂直的90 度方向通过光学系统（透镜、光栏、滤片和光检测器等）收集。荧光和侧向角散射光检测器是光电倍增管，前向角散射光检测器是光电二极管。在前向小角（2-10 度）进行检测的散射光信号称为“前向角散射光”。这种光散射信号反映

5、了细胞的体积。细胞发出的荧光信号和光散射信号同时被90 度角方向的荧光光电倍增管和前向光电二极管接收，被放大积分后转换为电子信号输入多道（1024 道）脉冲高度分析仪，并在计算机屏幕上，以一维直方图、二维位图、或三维图形显示出来。或将图形和数据直接输入联机专用的计算机，或存入磁盘以备Becton Dickinson Immunocytometry System - 2 - 分析。计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞定量分析。2.2 液流系统液流系统的主要功能是将细胞依序送到测量区（流动室）接受检测。2.2.1 流动室（ Flow Cell ）台式机多采用密闭式液

6、流系统，因此液流压力与鞘液流流速皆为原厂预设，需要人为调整，故而操作简单。加上仪器内之激光光路亦为原厂预先调设，因此较适用于临床检验与基础科研。流动室 (Flow Cell) 是仪器核心部件，由石英玻璃制成，被测样品在此与激光相交。这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。流动室是样品与鞘液相互混合的小室（参见图例）。流动室内充满鞘液，样品试管中的细胞被一高于整个液流系统的压力推入流动室中，与鞘液相混后，经由流动室中心之微细水路向上游动，鞘液则在此时包被水路，并藉由流体原理，使细胞能以单一细胞之形态，逐

7、一流经最窄的水路到达测量区，而与激光光交会。常使用的鞘液流为等张溶液如phosphate-buffered saline ，若配合特殊实验可改用无菌的细胞培养液。2.2.2 控制样品的流速实验样品的检测速度可以通过改变样品试管中的压力来控制，仪器面板中有三种预设样品的流速；高速为每分钟60 微升，中速为每分钟 36 微升，低速为每分钟12 微升。改变样品的检测速度会影响细胞向上游动的水路的直径大小，同时影响实验数据的变异系数。高速时水路的直径大，受测细胞可偏离水路中轴，或左或右移动而增加变异系数。这一现象在某些要求低变异数的实验中，需要避免，如做DNA分析时流速必须较低，控制在每秒两百个细胞左

8、右可达到较佳的结果；一般做淋巴细胞表面抗原分析时则无流速限制，可以高达每秒上千个细胞，而无损仪器辨识力。2.3 光学系统Becton Dickinson Immunocytometry System - 3 - 仪器中含有一系列光学元件，包括激发光源、透镜、光栅和滤片等，它们的主要功能是产生并收集荧光、光散射等信号。2.3.1 激光器激光基本沿着直线传播，发散角小，很容易聚焦到与细胞同一数量级。激光的亮度高，即在单位面积、单位立体角内输出功率特别大。激光还具有良好的单色性，这些特点使激光成为细胞仪光源的首选。FACSCalibur 基本配有一支波长488 nm 的氩离子激光器。氩离子激光器也是

9、目前最常被使用在流式细胞仪中的光源。FACSCalibur 可选配第二根气冷式激光器，产生之635 nm 波长之红色光束，配合APC、TOTO-3 、TO-PRO-3 等红光激发染料的使用（见表一），可应用于四色荧光之分析。用双激光光源的仪器扩大了其分辨的标记信号范围和种类。2.3.3 滤片流式细胞仪中所用的滤片有很多种，有带通滤片、长通滤片、短通滤片等。长波通滤片只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的光线滤掉，如650nm 长波通滤片只允许PerCP 发射的红色荧光通过，而488nm 的激发光及FITC 发射的525nm 绿光全部被阻。带通滤片的应用则正好相反，它只允许某一特定波长的光

10、线通过，例如一530 nm 带通滤片只允许 FITC 发射的530 nm 绿色荧光通过，而其它波长的荧光全部被阻断。FACSCalibur 基本配备有(1) 带通滤片：488/10, 530/30, 585/42 Bandpass （四色机型：661/16）。(2) 长通滤片：650 Longpass (四色机型：670 LP) 。 (3) 长波通二色性反射镜：DM640 LongPass 。(4) 短 波 通 二 色 性 反 射 镜 ： DM560 ShortPass。同时，测定侧方散射光时，加用双向分色滤片（Dichromic 90/10 beam splitter）。图示FACSCali

11、bur 流式细胞仪中滤片的基本设置。Becton Dickinson Immunocytometry System - 4 - 2.4 电子系统电子系统主要有三个功能：(1) 将光学信号转换成电子信号。 (2) 分析所输出的电流信号，以脉冲高度、宽度、积分面积显示。 (3) 量化信号并传至计算机。2.4.1 光电探测器（Photodetectors）：光电探测器的用途是将光学信号转换成电子信号。FACSCalibur细胞仪使用两类探测器：硅晶光电二极管及光电倍增管（PMT ）。光电二极管与光电倍增管各有其优点，光电倍增管在光线较弱时有很好的稳定性，而当光线很强时光电二极管就比光电倍增管稳定，所

12、以FACSCalibur 在探测FSC 时用光电二极管；在探测荧光与SSC 时，由于光信号较FSC 弱得多，所以探测器灵敏度是主要因素，必须使用光电倍增管。光电倍增管接收外来的光子信号并释出光电子，利用磁场将光子撞击到倍增电极上释出电子，再撞击到下一个倍增电极产生更多的电子，经过这一连串的撞击能放大并产生相当多的电子，最后再以阳极收集最终所有的电子，并产生输出电流信号。使用光电倍增管的优点除了可提高光信号之外，真正信号与噪声之比值也较高。2.4.2 信号的产生及处理光电二极管及光电倍增管所输出的电流信号，经由初步放大器（pre-amplifier ）转换成电压，再经由主波放大器（main pu

13、lse amplifier ）将所需之信号放大与处理（参见图）。信号的放大可以使用线性（ linear）或对数（ logarithmic ）两种型态，一般前向及侧向角散射光光的信号使用线状放大，因为散射光变异范围较小；而由于荧光信号变异范围较大，所以多使用对数放大，唯一例外的是DNA 分析时是使用线性放大，因为希望维持荧光信号与DNA含量的正比关系。2.5 散射光的测量在流式细胞仪中，从光的散射信号可以得到非常有价值的数据，因为细胞对光的散射是细胞在未遭受任何破坏情况下固有的特性，所以可以用散射光的信号对未染色的活细胞进行分析。细胞在液流中通过测量区时，Becton Dickinson Imm

14、unocytometry System - 5 - 经激光照射，细胞向空间360 度角的所有方向发射光线，散射的信号与细胞的大小、形状、质膜、和细胞内部的折射率有关。在流式细胞术中常用的有前向角散射光（FSC）和侧向角散射光（SSC），前者亦称 0 度角散射，后者亦称90 度角散射。2.5.1 前向角散射光（FSC）前向角散射光亦称小角散射或0 度角散射。一般我们仅能说前向角散射光的强度与细胞的大小有关。对同一个细胞群体，散射光强的，其细胞大一些；而散射光弱的，其细胞小一些。究竟更准确的关系是什么，因细胞不同、处理方法不同、固定方法不同，以致我们无法讲出更精确的结论。甚至当细胞是非球形的如鸡红

15、血球、扁平状的精子时，由于细胞在液流中空间取向的不同，也可导致对同型细胞测得的前向角散射光信号完全不同，这是必须注意的。2.5.2 侧向角散射光（SSC）侧向角散射光亦称90 度角散射或大角散射，收集到的是细胞通过测量区时侧方向的散射光。侧向角散射光的强度与有关细胞内部的精细结构和颗粒性质有关。当然，侧向角散射光光也与细胞形状、大小有关，但这不属于侧向角散射光获取数据的主要方面。以上所有的散射光与入射光波长一致，这是散射光与荧光的最大不同之点。散射光的探测器可以是硅光二极管，也可以是光电倍增管，前者多用于探测前向角散射光，后者用于探测侧向角散射光光。在实际使用中，仪器首先是对光散射信号进行测量

16、。因为通过测量区的每个细胞不管它是否已被染色都能Becton Dickinson Immunocytometry System - 6 - 散射光线，所以光散射分析与荧光探针联合使用时，可鉴别出样品中被染色的细胞和未染色的细胞，光散射测量最有效的用途，是从非均一的群体中鉴别出某些亚群。用前向角散射和侧向角散射光双参数测定，可从不加任何染料的小鼠全骨髓中鉴别出若干个亚群。举例而言，流式细胞仪可依据光散射信号将人白细胞分成三个亚群，淋巴细胞，单核细胞与粒细胞：淋巴细胞FSC 与 SSC 都小，单核细胞FSC 大与 SSC中等，而粒细胞FSC 与 SSC都大。2.5.3 电压阀值的设定由于流式细胞仪的高敏感度，只要溶液中稍有杂质就很容 易 产 生 一 微 小 电 压 信 号 ， 所 以 必 须 设 定 电 压 阀 值（threshold voltage ），所有进入的信号必须高于此阀值才被接收为信号，操作者一般对前向角散射光设定阀值，来排除杂质或细胞碎片或体积变小的死细胞。2.5.4 线性测量和对数测量的选择散射光测量时通常使用线性放大器，即放大器的输出与输入是线性关系，输入增大