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1、4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)： 1、试剂配制 （1）甲苯 （2）磷酸笨二钠：称取 6.75g 磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至 1L（1 毫升含 25mg 酚） （3）缓冲液 （4）p9.0 硼酸盐缓冲液： 硼酸盐缓冲液（pH9.0） A：0.05M 硼砂溶液：19.07g 硼砂（Na2B4O710H2O）溶于 1000mL 蒸馏水中 B：0.2M 硼酸溶液：12.37g 硼酸（H3BO3）溶于 1000mL 蒸馏水中 硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB 混匀即得缓冲溶液配制： (1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0) A：0.2M 醋酸
2、钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于 1000mL 蒸馏水中，或是 27.2g 三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于 1000mL 水中。 B：0.2M 醋酸溶液：11.55mL 醋酸定容于 1000mL 醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA3mLB 混合即得 （2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0） 硼砂氢氧化钠缓冲液（pH10.0）： A：硼砂液：19.072g 硼砂溶于 1000mL 蒸馏水中 B：氢氧化钠溶液：4g 氢氧化钠溶于 1000mL 蒸馏水中 50mLA43mLB 加水稀释至 200mL，混匀即得（4）中性磷酸酶：柠檬酸盐缓冲液 （pH7.0
3、） A：0.1M 柠檬酸溶液：21.01g 柠檬酸. H2O（或是 19.21gC6H8O7）溶于 1000mL 蒸馏水中 B：0.2M 磷酸氢二钠：35.61g 磷酸氢二钠.2 H2O（53.63g 磷酸氢二钠.7 H2O 或是 71.7g 磷 酸氢二钠.12 H2O）溶于 1000mL 蒸馏水中 柠檬酸盐缓冲液（pH7.0）：3.63mLA+16.37mLB 混匀即得 （5）2.5铁氰化钾 （6）0.5的 4氨基安替吡啉溶液 （7）酚原液：2 克酚溶液蒸馏水定容致 1 升（2mg/mL） ，溶液在暗色中稳定。 （8）酚工作液：取 2.5mL 原液稀释至 100mL（0.05mg 酚/mL）
4、 2、操作步骤：称取 5土于 50mL 容量瓶中，加 1mL 甲苯，加塞塞紧轻摇 15min。再加入 5mL 磷酸苯 二钠（6.75g 溶于 1L 水）和 5mL 相应的缓冲液(酸性磷酸 酶用 p5.0 大醋酸缓冲液，中 性磷酸酶用 pH7.0 的柠檬酸缓冲液，碱性磷酸酶用 pH10 的硼酸缓冲液)，同时对每一土样 都设置用 5mL 水代替基质的对 照。仔细摇匀后放入恒温箱,在 37下培养 24。 用热至 38的蒸馏水将容量瓶中混合物稀释至刻度(甲苯浮在刻度以上)，再用致密滤纸过 滤。取 1mL 滤液于 100mL 容量瓶中，加 5mL p9.0 硼酸盐缓冲液，再加入 3mL 2.5的 铁氰化钾和 3mL 0.5的 4氨基安替吡啉溶液，摇动，仔细混匀，这时溶液呈粉红色，然 后加水定容。待颜色稳定时（20-30min） ，在波长 570nm 处测定各样品的 消光值。土壤的 磷酸酶活性根据标准曲线求出酚的含量。 磷酸酶活性以每克土壤的酚毫克数表示（若用 P 的毫克数表示，结果需乘 0.32；若用 P2O5 的毫克数表示，需乘 2.29） 。标准曲线：分别向 100mL 容量瓶中注入 1，3， 5，7，9，11mL 工作液并显色定容（分别 相当于 0.05，0.15，0.25，0.35，0.45，0.55mg 酚） ，待颜色稳定后，比色绘制标准曲线。
