实验五荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色

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1、实验五 荧光显微镜的使用和细胞的荧光染色【实验目的】掌握荧光显微镜的原理和使用；掌握生物材料荧光染色的原理和应用。【实验原理】吖啶橙（ acridine orange，AO ）是最经典的极灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和 RNA同时染色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm ，荧光发射峰为530nm （DNA ） 、640（RNA ） ，它与双链 DNA 的结合方式是嵌入双链之间， 而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光（ 502nm ）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约530nm ） ，核仁和胞质 RNA发橘红色荧光 （580nm ） 。吖啶橙的阳离子也可以

2、结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但细胞固定阻抑了这种结合，从而主要显示DNA 、RNA两种核酸。【实验用品】1、器材荧光显微镜、牙签、载玻片、盖玻片、滴管、吸水纸。2、试剂（1）0.1mol/l pH7.0 PBS液A液：NaH2PO4H2O 2.76g ，加蒸馏水至100ml；B液：Na2HPO47H2O 5.36g ，加蒸馏水至100ml；取 A液 16.5ml B液 33.5ml NaCl 8.5g ，用蒸馏水稀释至100ml。（2）1% 吖啶橙原液取 0.1g 吖啶橙加蒸馏水稀释至100ml（临用时配制0.01%吖啶橙染液： 将1% 吖啶橙原液用pH7.0 PBS 溶液稀释 10 倍

3、） 。3、材料口腔黏膜上皮细胞临时制片或人肝癌BEL-7402细胞爬片。【方法与步骤】（1）取口腔上皮细胞涂在干净载玻片上。（2）95% 乙醇溶液固定5min。（3）滴加 0.01%吖啶橙染液 5min。（4）盖上盖玻片，吸水纸吸去盖玻片周围多余液体，镜下观察。【结果与观察】荧光显微镜下（选用蓝色激发滤片），可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA 的细胞质及核仁显示橘红色荧光体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色【注意事项】（1）制片后一定要晾干玻片，在进行后续步骤，否则会导致细胞脱落。（2）每种荧光染料，均有自己的最适pH，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH缓冲液中进行。