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1、实验四麦清蛋白的初步提取生物 112 周泓兆1102040226 一、研究背景无论是在科学研究还是商业化产品的开发中，生物大分子的分离纯化似乎都是开发所需要的。随着人们对某一特定目标产物活性与纯度的需求逐渐增大，人们努力寻找目标物的自身特性，不断探索新的技术以提高纯化水平。在所有的分离纯化技术中，层析技术以其独特的优势始终占据着生物大分子纯化的主导地位。层析法是利用不同物质理化性质的差异而建立起来的技术，从本质上来讲它就是将目标分离产物与杂质的显著差异转化为迁移距离上的差异，从而达到分离提取的目的。层析法具有明显的优势： （1）从理论上来讲，只要迁移距离足够长，任何物质都可以从其所在的混合体系
2、中被分离出来； （2）除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等； （3）基于不同的原理，层析法衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术；（4）可以尽可能地保护目标物不受损坏，保持其活性。基于以上原因，层析法在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。二、研究目标1.以凝胶过滤层析法完成麦清蛋白的脱盐以验证该技术的可行性；2.掌握层析技术的基本操作方法；3.体会相关技术的发明思路和历程，领悟新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用。三、研究策略1、
3、选材本次实验我们以新鲜的小麦种子为材料，分离纯化麦清蛋白。采取粉碎后加水震荡的方法提取麦清蛋白。2、粗提取离心后除去麦种残渣，使用硫酸铵的中性盐沉淀法对麦清蛋白进行粗分离，分离后的蛋白质中含有无机盐等小分子杂质。3、提纯采用凝胶过滤层析法脱盐，连续收集洗脱液。4、鉴定 用紫外分光光度计测定各阶段收集液的OD280值以检测蛋白含量，确定蛋白质峰值管并保存。5、检测脱盐效果采用比浊法以BaCl2检测纯化产物中硫酸根离子的存在情况从而判断凝胶过滤层析的脱盐效果。四、研究方案及可行性分析凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根据被分离物质的分子大小不同来进行分离
4、，也被称为体积排阻层析、分子筛层析。凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动， 首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长， 移动速率慢而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样， 由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后， 混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。在凝胶过滤层析中，选择适宜的凝胶是取得良好分离效果最根本的保证。蛋白样品的脱盐或蛋白、 核酸溶液去除小分子杂质以及一些注射剂去除大分子热源物质等等，一般常用排
5、阻极限较小的凝胶类型。选择时要依据分离的具体情况而定，例如样品中各个组分差别较大，则可以选用大颗粒的凝胶，这样可以很快的达到分离的目的；如果有个别组分差别较小，则要考虑使用小颗粒凝胶以提高分辨率。实验方案合理， 简便易行， 实验材料及器具基础生物化学实验室均可提供，时间上也允许，故本方案具有较高的可行性。五、具体实验设计1、仪器：离心机、托盘天平、紫外分光光度计、层析柱、恒流泵、部分收集器、微量可调 手动移液器、研钵。2、试剂：饱和（NH4）2SO4溶液、 1%的 BaCl2溶液、洗脱液、蒸馏水。3、材料：新鲜小麦种子、葡聚糖凝胶G-25。4、具体操作步骤（1） 溶胀凝胶（教师完成）称取适量葡
6、聚糖凝胶G-25加入足量蒸馏水或洗脱液沸水浴溶胀5h搅拌使其悬浮静置，使大部分凝胶沉降用倾斜法除去含细碎颗粒的上层液反复多次，直至无细颗粒为止将凝胶在真空干燥器中减压除气，准备装柱（ 2 ） 装 柱（3.5h）层析柱下端止水装入约1/4 柱长的洗脱液（湿润凝胶团）倒入凝胶，开启洗脱装柱至3/4 左右，注意使柱中凝胶一直处在溶液中（注意装柱完成后层析柱下端需适时止水以保证洗脱液面高于凝胶页面3-5cm）凝胶沉降完成，旋上柱帽并连接洗脱系统，平衡洗脱3h连接恒流泵和收集检测系统，调节好流速和收集系统以备下用（控制流速为每滴10 秒，收集量为每管3 毫升）（3） 盐析法分离提取麦清蛋白（2h）粉碎
7、2g 小麦种子置于三角瓶中，加20ml 蒸馏水连续震荡0.5h，再间歇震荡0.5h3000r/min 离心 20min ，取上清液（澄清透明，否则再过滤，尽可能保证粗提取后杂质只有无机盐）用醋酸调pH 至 4.7（调节至等电点，使蛋白更易析出）边搅拌边加入等体积的饱和硫酸铵溶液，有白色絮状沉淀产生，冰箱冷藏室过夜3000r/min 离心 20min，弃上清液，加 2ml 去离子水充分溶解沉淀，得混合液，准备上样脱盐。（ 4 ） 上 样（1h）在柱内放入滤纸片用恒流泵加速按钮使洗脱液面和胶床表面相齐，停止洗脱将1ml 样品提取液注入凝胶床面中央，开启洗脱和收集器收集待样液与凝胶床面相齐时用滴管加
8、入略高于刚才上样高度的洗脱液（重复两次）用滴管加入35 厘米高的洗脱液层戴上柱帽，连续洗脱收集（5）洗脱、收集和鉴定（1.5h）每 3ml 收集一管用紫外分光光度计在280nm 处测消光值以管号为横坐标，消光值为纵坐标，绘制洗脱曲线，确定蛋白峰值管分别向各管加入两滴1%的 BaCl2溶液（易错：蛋白峰值管中不要加入BaCl2） ，用比浊法比较脱盐效果。5、原始数据记录处管号1 2 3 4 5 6 7 OD280管号8 9 10 11 12 13 14 OD280管号15 16 17 18 19 20 21 OD280六、质疑及相关思考1、生物大分子有哪些可利用的性质来完成其自身的纯化？答：可以
9、利用生物大分子的等电点进行纯化；难溶生物大分子可以通过盐溶的方法进行纯化，可溶的生物大分子可以通过盐析的方法进行纯化；结构比较稳定的生物大分子可以通过有机溶剂沉淀的方法纯化；通过特定条件变性所需生物大分子使其沉淀，完成纯化；利用生物大分子质量、密度、 形状的差异， 通过密度梯度离心分离纯化；利用生物大分子的质量进行凝胶过滤层析提纯；生物大分子的电荷不同，通过电泳的方法对其进行分离纯化。根据生物大分子的吸附性不同，通过层析对其进行分离纯化。2、以至少两种纯化生物大分子的层析技术为例，探讨它的发明思路。答：凝胶过滤层析：在蛋白质的粗分级中常用的分离手段是中性盐沉淀以及等电点沉淀，而两种方法所面临的
10、一个问题就是如何除去粗分离后蛋白质中残留的无机小分子。凝胶过滤层析的原理有些接近层析法，利用蛋白质分子与无机盐离子的大小不同进行分离，可是层析法需要大量层析液，而且纯化程度低（残留无机盐离子较多），因此人们利用分子的大小差异，改变其通过的路径，从而通过大小不同的分子洗脱时间不同完成分离纯化，发明了凝胶过滤层析。疏水作用层析： 如果两种生物大分子体积和分子质量相当，我们只能通过它们更加细致的特性进行分离。于是人们考虑到利用生物大分子的不同基团对不同物质的吸附性进行层析。从而发明了疏水作用层析，通过带有较强疏水基团的吸附剂，利用不同生物大分子与吸附剂的疏水作用强弱差别对其进行分离纯化。3、试着探讨
11、一下一项新技术发明的思维及实施过程。答：通常情况下，随着时间的推进，人们遇到的问题越来越需要分析他们的个性。因此新技术的发明思路往往是考虑我们的研究对象与其它物质的不同之处，从而完成对其的分离检测等等。而实施的过程中我们需要去寻找或者去发明对研究对象具有较明显特异性的材料或者试剂，才能更好地达到我们的实验目的。4、中性盐沉淀中硫铵分级沉淀是蛋白质粗分级中最常用的手段，为什么？答：因为不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同， 故盐析所需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离。 硫铵分级沉淀操作简单，硫酸铵溶解性好易除去，并且能对不同蛋白质进行粗分离，同时不会导致蛋白质变性，因此硫铵分级沉淀是蛋白质粗
12、分级中最常用的手段。5、本次实验中，洗脱液应该是什么？选择的依据是什么？答：本次实验中是分离麦清蛋白，故洗脱液的pH 应该远离目标蛋白的等电点；对于分子量较大的物质， 溶液的粘度随浓度增加而增大，使得分子运动受阻，故洗脱液与样品的相对粘度不得超过1.5-2；实验填料使用的交联葡聚糖凝胶为强酸性物质，含羧基基团，能与分离物中带电基团发生吸附，此吸附作用可以借助提高洗脱液的离子强度克服。故洗脱液应需要有一定的离子强度和pH，可选取缓冲溶液或者盐溶液或蒸馏水。本实验中，麦清蛋白等电点为4.5-4.7，交联葡聚糖在强酸性条件下会发生水解破坏其结构，故洗脱液可用0.020.1mol/L pH6.98.0 的 PBS 液（ 0.14mol/L NaCl ） 。
