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1、型垦兰堕堡丝苎一英文缩写及全称A AA TA U耵lC DI F N YI L 1 2I L 一4T G F - 1 3 1P B M CT N F英文缩略词表a l o p e c i aa r e a t ap a t c h ya l o p e c i aa r e a t aa l o p e c i at o t a li sa l o p e c i au n i v e r s a l i sTh e l p e rc l u s t e ro fd i f f e r e n t i a t i o nI n t e r f e r o n - YI n t e r l e
2、u k i n s 一1 2I n t e r l e u k i n s 一4t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r p1p e r i p h e r a lb l o o dm o n o n u c l e a rc e l l st l J m o rn e c r o s i sf a c t o r中文词义斑秃斑块型斑秃全秃普秃T 辅助分化决定簇干扰素v白介素1 2白介素4转化生长因子一B1外周血单个核细胞肿瘤坏死因子广州医学院硕七论文C D 4 + C D 8 + T 细胞、T h l T h 2 型细胞因子与斑秃关系的研究研
3、究生：黄卫宁导师：徐霞广卅I 医学院第一附属医院皮肤科摘要背景斑秃( a l o p e c i aa r e a t a ，A A ) 是一种常累及头皮的慢性炎症性疾病，以突发性、非疤痕性的毛发脱落为特征，常给患者带来巨大的心理压力和精神创伤，严重影响患者的工作和生活。目前斑秃的病因和发病机理尚未完全明了，主要与遗传易感性、免疫功能失调、神经精神因素及环境因素有关。国内外多数学者倾向于认为斑秃是在遗传易感性的基础上，由复杂的多种激发因素介入，以细胞免疫为主的针对生长期毛囊致毛发脱落的器官特异性自身免疫病。尽管斑秃的发病途径尚未完全明了，但体内、体外实验均已表明，其发病机理与毛囊周围C D 4
4、 * T 淋巴细胞浸润和毛囊内C D 8 + T 淋巴细胞浸润密切相关，而细胞因子是由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类生物活性物质，多种细胞因子在斑秃的发病过程中发挥了主要作用，尤其是T h l T h 2 型细胞因子的表达失衡。y 干扰素( I n t e r f e r o n - y ，I F N Y ) 、白介素1 2( I n t e r l e u k i n s - 1 2 ，I L 一1 2 ) 是促进T 淋巴细胞T h l 型细胞因子反应及抑制T h 2型反应的关键性因子，白介素4 ( I n t e r l e u k i n s - 4 ，I L 一4 )
5、 可抑制T h l 细胞分化和功能。在器官特异性自身免疫性疾病中，疾病过程，T h 2 能阻止发病，缓解病情。T h l 细胞因子占优势可诱导发病，加速由于斑秃患者存在T h l 反应状态，因此抑制T h l 型细胞因子或促进T H 2 型细胞因子的产生，或诱导T h l 型淋巴细胞向T h 2 型细胞漂移，都有望成为治疗斑秃新的靶位及策略。利用基因工程将表达T h 2型细胞因子的基因导入斑秃局部毛囊于细胞，逆转T h l 型反应也有望成为今后研究和治疗的方向。2广州医学院硕士论文目的1 、探讨C D 4 + 、C D 8 + T 淋巴细胞表达情况与斑秃发病的关系2 、通过探讨T h l T
6、h 2 型细胞因子与斑秃的发病机制的关系，为治疗斑秃新的策略和靶位提供有力的实验依据。3 、观察T G F B1 因子的水平与斑秃发病的关系，探讨斑秃病情的检测和疗效的观察指标。方法应用流式细胞术检测3 4 例重型斑秃、2 6 例轻型斑秃和2 2 例正常人的C D 4 + 、C D 8 + T 淋巴细胞的表达水平，同时应用酶标法检测I F N Y 、I L - 1 2 、I L - 4 、T G F 一6l 等细胞因子的水平。结果1 、斑秃患者P B M C 中C D 3 + 、C D 4 + 、C D 8 + T 淋巴细胞表达情况( 1 ) 重型斑秃、轻型斑秃的C D 4 + T 、C D
7、8 + T 淋巴细胞均明显高于正常对照组，差异有显著性，而重型斑秃虽然比轻型斑秃高，但差异无显著性。( 2 ) C D 4 + C D 8 + 比值：重型斑秃和轻型斑秃的C D 4 + C D 8 + 比值均高于正常对照组，但差异无显著意义。( 3 ) 重型斑秃、轻型斑秃的C D 3 + T 淋巴细胞均比正常对照组高，但差异无显著性( P O 0 5 ) 。2 、斑秃患者血清中T h l T h 2 型细胞因子水平( 1 ) T h l 型细胞因子I F N - Y 表达水平：重型斑秃、轻型斑秃均较正常对照组有所升高，且有显著差异( P O 0 5 ) 。( 3 ) T h 2 型细胞因子I
8、L - 4 表达水平下调，重型斑秃、轻型斑秃均较正常对照组有所降低，且有显著差异( P O 0 5 ) 。3 、斑秃患者血清中T G F - B1 的表达情况重型斑秃、轻型斑秃的血清T G F 一1 31 水平明显低于正常对照组( P 6 5 岁者；1 2广州医学院硕士论文二、仪器设备流式细胞仪( 美国B D 公司F A c S C A N ) ：自动酶标光度仪( 北京普朗公司D N M 一9 6 0 2 ，4 5 0 h m ) ；漩涡振荡器；自动洗板机；高精度移液器及吸头；3 7 温箱，双蒸水：离心机；三、试剂人I F N YE L I S A 试剂盒( 广州晶美生物工程有限公司) ；人I
9、 L - 1 2E L I S A 试剂盒( 广州晶美生物工程有限公司) ：人I L 一4E L I S A 试剂盒( 广州晶美生物工程有限公司) ；人T G F - B1E L I S A 试剂盒( 广州晶美生物工程有限公司) ；P B S 洗液；C D 4 一P E 细胞单抗( 美国叻公司) ；C D 8 一P E 细胞单抗( 美国B D 公司) ：C D 3 - F I T C 细胞单抗( 美国叨公司) ；R B C 裂解液( 美国B D 公司) 。四、实验方法( 一)标本采集抽取患者静脉血5 m l ，其中E D T A 抗凝管2 m l ，1 小时内送检流式细胞仪；促凝管3 m l
10、，1 0 0 0 r m i n 离心8 分钟，分离血清后冻存于一7 0 待测细胞因子。( 二)检测C D 4 + 、C D 8 + T 淋巴细胞检测原理：将待测标本制备成单细胞悬液，用特异性荧光标记细胞中待测成分，上流式细胞仪检测时待测细胞随流动室内的流动鞘液排成单列一个个迅速通过( 常5 0 0 0 个细胞行) 激光聚焦，激光在对每个细胞照射时可同时得到前向角散射广州医学院硕士论文( F S C ) 和侧向角散射( S S C ) ，两种散射光以及激发荧光标记物发出的信号。F S C 与被测细胞的大小有关，S S C 可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。利用F S C 和S S C
11、提供的有关细胞大小和结构信息，即可对血液中的淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞、血小板等有形成分进行初步分类，而荧光标记的单克隆抗体目前可提供单色至四色荧光信息，对待测细胞上的待测成分进行单项或联合检测，对大小和结构类似的细胞根据生物标记的不同加以进一步的区分。操作流程：( 1 ) 、每份患者标本用3 支1 2 X7 5 r a m 流式管，分别标上标本号和管号C 、D 、E ；( 2 ) 、取2 0 u1 试剂C ( C D 3 - F I T C 细胞单抗) 加到标本C 管中，取2 0 Pl 试剂D ( C D 4 一P E 细胞单抗) 加到标本D 管中，取2 0 l ll 试剂E ( C
12、 D 8 一P E 细胞单抗)加到标本E 管中；( 3 ) 、向标本的试管中准确加入1 0 0pl 抗凝全血，充分混匀，室温( 2 0 “ C - - 2 5) 避光反应2 0 一3 0 分钟；( 4 ) 、每管加入2 m l1 红细胞裂解液( 工作液2 0 “ C 一2 5 ) ，充分混匀，室温( 2 0 “ C - - 2 5 “ C ) 避光反应1 0 1 2 分钟，至液体透明；( 5 ) 、1 0 0 0 r m i n 离心5 分钟，弃上清：( 6 ) 、加入2 m lP B S 洗液，1 0 0 0 r m i n 离心5 分钟，弃上清；( 7 ) ，加入0 5 m ll 甲醛溶液
13、固定细胞，混匀，2 4 小时内上流式细胞仪。检测细胞因子( 三) 血清I F N - y 浓度测定检测原理：采用生物素一亲和素E L I S A 双抗体夹心法进行检测。标本中的I F N Y 与酶标板上包被的I F N Y 单克隆抗体结合，反应完全后洗涤，再加入B i o - I F N y 单克隆抗体，形成固相抗体一待测抗原一生物素化抗体复合物，洗涤后加入酶标记的链霉亲和素，待生物素、链霉亲和素结合完全，洗涤去除未结合的酶，加入T M B 底物显色，测量吸光度值A 4 5 0 。操作流程：1 4广州医学院硕士论文( 1 ) 、从冰箱内取出试剂盒，放置2 0 分钟，待平衡至室温后，从密封带中取
14、出所需板条；( 2 ) 、将浓缩洗涤剂用双蒸水以l ：2 0 稀释；( 3 ) 、配置不同浓度标准品：加入标准品标本稀释液1 0 m l 至冻干标准品中，待彻底溶解后，静置1 5 分钟混匀( 浓度为2 0 0 0 p g m 1 ) 。取6 支试管，分别标上l 、2 、3 、4 、5 、6 ，并分别加入5 0 0 ul 的双蒸水，在第1 管 ) J H A , t q l 配制的浓度为2 0 0 0 p g m l 的标准品，混匀；从第1 管中吸取5 0 0 1 , 1 1 加入第2 管，混匀；从第2 管中吸取5 0 0 l a l 加入第3 管，混匀；从第3 管中吸取5 0 0 u 1 加入
15、第4 管，混匀；从第4 管中吸取5 0 0 1 1 1 加入第5 管，混匀；从第5 管中吸取5 0 0 pl 加入第6 管，混匀。这样就得到浓度分别为1 0 0 0p g m l 、5 0 0p g m l 、2 5 0p g m l 、1 2 5p g m l 、6 2 5p g m l 、3 1 2 5p g m l 的标准品：( 4 ) ，除空白孔外，分别将血清标本或不同浓度的标准品( 1 0 0 1 孑L ) 加入相应孔中，用封板胶纸封住反应孔，3 7 “ C 孵箱孵育9 0 分钟；( 5 ) 、洗板4 次；( 6 ) 、配制生物素化抗体工作液：以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体
16、( 1 ：1 0 0 ) ：( 7 ) 、除空白孔外，加入生物素化抗体工作液( 1 0 0 u1 孔) 。用封板胶纸封住反应孔，3 7 “ c 孵箱孵育6 0 分钟；( 8 ) ，洗板4 次；( 9 ) 、配制酶标记链霉亲和素的：以酶结合物稀释液l ：1 0 0 稀释浓缩酶结合物；( 1 0 ) 、除空白孔外，加入酶结合物工作液( 1 0 0 “1 孔) 。用封板胶纸封住反应孔，3 7 “ c 孵箱孵育3 0 分钟；( 1 1 ) 、洗板4 次；( 1 2 ) 、加入显色剂1 0 0p1 孔，避光3 7 “ c 孵箱孵育2 0 分钟；( 1 3 ) 、加入终止液1 0 0I l1 孔，混匀后I P N Y , I 量0 1 ) 4 5 0 值；( 1 4 ) 、结果判断：每个标准品和标本的O D 值减去零孔的0 D 值；绘制标准曲线：以标准品浓度作横坐标，0 D 值作纵坐标，以平滑线连接各标准品广州医学院硕士论文的坐标点；通过标本的o D 值在标准曲线上查出其浓度
