《DC联合CIK治疗NSCLC的基础和临床研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DC联合CIK治疗NSCLC的基础和临床研究（72页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：建立适用于临床治疗的规范的树突状细胞( d e n d r i t i cc e l l 。D C ) 联合细胞因子诱导的杀伤细胞( c y t o k i n ei n d u c e dk i l l e r , C I K ) 免疫治疗体系，为形成新的非小细胞肺癌( N S C L C ) 个体化综合治疗模式奠定基础；比较D C 联合C I K 结合化疗组与常规化疗对照组的治疗效果，从而客观全面地评价D C 联合C I K 治疗肺癌的临床有效率，为D C 联合C I K 的推广应用和科学评价提供有价值的资料。方法：1 采集了2 0 例N S C L
2、C 患者外周血单个核细胞加入各种细胞因子体外培养D C 及C I K ，D C 培养至第7 天时加入培养的C I K ，L D H 方法检测C I K 细胞的杀伤活性，E L I S A 及E L I S P O T 方法检测C I K 分泌细胞因子水平，流式细胞术检测D C 与C I K 共同培养后C I K 的表型。2 临床研究采用D C 联合C I K 与常规化疗间隔进行的方案，选择了1 2 0 例N S C L C 患者进行研究，包括5 0 例术后患者和7 0 例晚期患者。分别对术后生物治疗组和晚期生物治疗组患者进行生存分析，通过影像学检查、生化检查，观察生物治疗患者临床疗效变化，依据
3、卡氏评分标准评价患者生活质量改善状况。3 设立常规化疗对照组，选择术后生物治疗+ 化疗组、常规化疗组同期配对患者各4 2 例，晚期生物治疗+ 化疗组、常规化疗组同期配对患者各6 1 例，比较生物治疗+ 化疗组与常规化疗对照组的无病生存率及总生存率。4 应用细胞因子抗体芯片技术检测1 0 例N S C L C 患者生物治疗前后外周血细胞因子，比较生物治疗前后细胞因子的表达水平，同时，观察临床疗效与细胞因子变化的关系；流式细胞术检测肺癌患者生物治疗前后外周血T 细胞亚群及N K 细胞。结果：1 D C + C I K 对肺癌细胞系A 5 4 9 、乳腺癌细胞系M C F 7 、结肠癌细胞系H C
4、T - 8 和淋巴瘤细胞系R a j i 的杀伤活性均高于单纯C I K 组( P 4 次较g 次患者的2 年无病生存及总生存率显著提高( 尸 。1 2 试剂。细胞培养液R P M I1 6 4 0( 美国I n v i t r o g e n 公司)F B S( 中国医学科学院血液病研究所)淋巴细胞分离液( 中国医学科学院血液病研究所)抗人C D 3 单抗( D y n a lB i o t e c hA S A )一r h l L 1 a( 军事医学科学院生物工程所)r M F N - 7( 河南雅康药业有限公司)r h I L 2( 北京双鹭药业有限公司)人肺癌细胞系A 5 4 9 、乳
5、腺癌细胞系M C F 7 、结肠癌细胞系H C T - 8 及淋巴瘤细胞系R a j i( 本室提供)人I L 一2 ，I L 4 ，G M C S F ，T N F a ，C D 4 0 L ，T G F p ，I L - 1 0 ，I F N 吖，I L - 1 0 ，I L 一6E L I S A 试剂盒( 北京晶美生物公司)C D 4 - F I T C C D 2 5 一R P E C D 3 - P E R C P 、C D 4 5 R O F I T C C D s R E 、C D 3 - F I T C C D 5 6 一R P E 、C D 3 F I T C C Dl6
6、+ 5 6 R P E C D 4 5 P E R C P( 均购自B DB i o s c i e n c e )1 3 仪器倒置显微镜( 日本O l y m p u s 公司)C S 一3 0 0 0p l u s 血细胞分离机( B a x t e r )分光光度计( B e c k m a n C o u l t e r )流式细胞仪( B DF A C S A r i a )加湿C 0 2 孵箱( T h e r m o )酶标仪( B i o T e c )酶联( E L I S P O T ) 斑点分析仪( S A M S U N G ) 2 方法4天津医科大学硕士学位论文2 1
7、D C 及C lK 细胞的培养分离肺癌患者外周血单个核细胞( P B M C s ) ，加入含1 0 F B S 的R P M I 1 6 4 0培养液调整细胞浓度为1 - 2 x 1 0 6 m l ，3 7 。C 、5 C 0 2 孵育2 h r 。其中贴壁细胞加入含1 0 0 0U m l 的I L 4 和1 0 0 0U m l 的G M C S F 的1 0 F B S R P M I 1 6 4 0 培养D C ，每3 天换液，第6 天加入5 0 0U i n lT N F - a 和1 0 0n g m lC D 4 0 L 。悬浮细胞用于培养C I K 。悬浮细胞加入1 0 0
8、n g m l 的抗C D 3 单抗、1 0 0U m l的人重组I L 1 伐，置3 7 ，5 的C 0 2 孵箱中培养。2 4 h 后，再加入5 0 0U m l 的人重组I L 2 、1 0 0 0 U m l 的重组人I F N T ，置3 7 ，5 的C 0 2 孵箱中继续培养，每3 天换一次液。培养至第7 天的D C 加入C I K 细胞，共培养至1 4 天，同时设不加D C 的单独C I K 组。2 2C I K 细胞表型监测收集D C 诱导C I K 及单独C I K 细胞，用P B S 洗涤1 次，将细胞移入U 型9 6 孔板中，每孔细胞数不少于5 x 1 0 5 个，分别加
9、入荧光抗体2 0 p l 轻轻混匀，4 “ 0避光孵育3 0 6 0 分钟。P B S 洗涤两次，每孔加入1 0 0 p 11 多聚甲醛固定。流式细胞仪检测细胞表面标志。用于C I K 检测的单抗包括：C D 4 一F I T C C D 2 5 R P E C D a P E R C P 、C D 4 5 R O F I T CC D 8 - R E 、C D 3 - F I T C C D 5 6 R P E 、C D 3 - F I T C C Dl6 + 5 6 - R P E C D 4 5 P E R C P 。2 3C I K 及D C + C I K 细胞杀伤活性检测杀伤实验的
10、靶细胞主要包括：人肺癌细胞系A 5 4 9 、乳腺癌细胞系M C F 7 、结肠癌细胞系H C T - 8 及淋巴瘤细胞系R a j i 。分别收集靶细胞和效应细胞，用1 6 4 0 培养液洗涤2 遍，计数，并调整细胞浓度，效应细胞和靶细胞按效靶比2 0 ：1 混合，加入9 6 孔U 型板中，每组3 个复孔。同时设靶细胞最大释放，自然释放，培养液空白对照和体积纠正对照，每组3 个复孔，离心2 5 0 x g4 分钟，3 7 5 C 0 2 孵箱培养6 小时，在培养结束前4 5 分钟，取出9 6 孔板，在靶细胞最大释放组和体积纠正对照组每孔加入N P 4 0溶解液2 0 9 l 。继续培养4 5
11、 分钟后取出，每孔吸出5 0 9 l 上清转移入另一9 6 孔板，每孑L ：b t l 底物溶液5 0 p l ，避光室温孵育3 0 分钟，加入5 0 p l 终止液，用振荡器将色素颗粒打散，测波长4 9 0 n m 处的吸光度，按下列公式：天津医科大学硕士学位论文杀伤率( ) =实验孔效应细胞自然释放孔靶细胞自然释放孔靶细胞最大释放孔靶细胞自然释放孔1 0 0 2 4C I K 及D C + C I K 细胞分泌细胞因子水平测定( E L I S A 法)分别取C I K 及D C 诱导后C I K 细胞，调整细胞浓度为5 x 1 0 5 m l ，接种于2 4孔板，每孔l m l ，4 8
12、 h r 后离心取细胞上清，E L I S A 检测C I K 及D C + C I K 细胞分泌I L 2 ，T G F B ，I L 1 0 ，I F N Y ，I L 6 水平。将标准品及待测样品加入相应反应孔，轻轻混匀3 0 秒，封住板孔，3 7 孵育2 0 分钟。洗板，每孔加入B i o t i n 和H R P 标记单抗，混匀，3 7 孵育2 0 分钟。洗板，加入底物A 、B ，室温孵育3 5 分钟。加入终止液，3 0 分钟内在酶标仪上读取O D 4 5 0 值。以O D 4 5 0 值为纵坐标，以标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，根据血清样品的O D 值，计算其浓度。2 5E L
13、 I S P O T 方法检测C I K 及D C + C I K 中分泌I F N - 7 的细胞数每孔用5 0 u l 稀释后的I F N - I 抗体包被，P B S 补至1 0 0 u l ，加盖，4 过夜。弃去液体，5 x 缓冲洗液冲洗，每孔加2 0 0 u l 封闭液B ，加盖，室温2 h r 或4 “ C 过夜。弃去液体，不洗板，加细胞，每孔5 1 0 4 细胞，每组3 个复孔。加盖，3 7 培养2 4 h r ，弃去细胞，每孔加2 0 0 u l 的用冰预冷的灭菌水，冰上1 0 r a i n ，用缓冲洗液冲洗1 0 次。每孔加1 0 0 u l 稀释后的生物素化标记抗体，用胶
14、条封板，3 7 孵育l h r 或室温2 h r 或4 过夜。弃去液体，用缓冲洗液冲洗5 次，每孔加5 0 u l 稀释后的Y -氨基丁酸，封板，3 7 孵育l h r 或室温2 h r 。弃去液体，用缓冲洗液冲洗5 次，拍净板内液体。每孔加3 0 u l 新配置的A c t i v a t o rI I Is o l u t i o n ，加盖，室温，避光放置15 3 0 m i n后光镜下观察，如有清晰的斑点，用去离子水冲洗终止反应。室温风干，计数。2 6 统计学方法应用S P S S1 3 0 统计学软件进行数据处理，数据以i S 表示。D C 、C I K及外周血单个核细胞( P B
15、M C ) 的表型分析，多次检测后取均值。C I K 与外周血单个核细胞( P B M C ) 的表型比较，C I K 与D C 诱导后的C I K 表型、杀伤活性、分泌细胞因子水平及对C D 4 + C D 2 5 + T r e g s 的影响的比较，采用配对f 检验。6查竖堕型丕堂堡主芏堡丝苎对百分比数据首先经平方根反正弦变换后，采用配对t 检验进行比较，以P 0 0 5 )2D C 细胞可诱导C I K 细胞杀伤活性增强应用L D H 方法检测C I K 及D C 诱导C I K 细胞在效靶比为2 0 ：l ，培养至第1 4 天时对肿瘤细胞的杀伤活性，共选择4 种肿瘤细胞系作为靶细胞，
16、包括肺癌细胞系A 5 4 9 、乳腺癌细胞系M C F - 7 、结肠癌细胞系H C T - 8 和淋巴瘤细胞系R a j i 。结果D C + C I K 组对4 种靶细胞的杀伤活性均高于单独C I K 组( 尸 00 5 ) ( 表5 ) 。表5 D C 诱导自U 后C I K 细胞表型变化( ，x J )T a b l e S T h ec e l lp h e n o t y p e o f C I Kb e f o r e - a n d a f t e r - i n d u c e d b y D C ( , r + 9 ) C I KD C + C I KP天津医科大学硕士学位论文讨论肿瘤的细胞免疫治疗即根据肿瘤的细胞免疫理论，以免疫活性细胞为主要载体进行的抗肿瘤免疫治疗。它既包括主动性免疫治疗，又包括过继性细胞免疫
