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1、1褪黑素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保 护作用【摘要】 目的 探讨褪黑素(melatonin,Mel)对大鼠缺血再灌注(IR)损伤的保护作用及机制。方法 通过手术建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型，将实验动物随机分为Sham 组、IR 组和 Mel+IR 组，测 IR 后 24 h 各组大鼠血清中尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）、肾组织匀浆中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量变化，并观察肾脏组织结构的病理变化。结果 IR 后 24 h 大鼠血清 BUN、Cr 水平明显升高，组织匀浆 SOD 活力明显降低，MDA 水平明显升高。Mel+IR 组较 IR 组肾脏 SOD活性明显升高（P0.0
2、1），MDA 水平明显降低（P0.01）；肾功能、组织变化较IR 组得到了明显改善。结论 褪黑素可通过提高组织抗氧化酶活性、降低组织脂质过氧化反应发挥对肾功能及肾脏结构的保护作用。 【关键词】 褪黑素 缺血再灌注损伤 超氧化物歧化酶 丙二醛Abstract Objective To investigate the protective effect and mechanism of melatonin on renal ischemia/reperfusion(IR) injury in rat . Methods Using an in vivo rat model of IR, we ob
3、served the change of BUN and Cr in blood serum, and changes of the activities of superoxide dismutase (SOD), and malondiadehyde (MDA) in homogenized kidney tissue, and tissue structural pathological change during 24h after reperfusion. Results The level of BUN and Cr in blood serum and MDA in homoge
4、nized kidney tissue production was significantly increased and the level of activities of SOD production was significantly decreased. The level of BUN and Cr and MDA in the Mel-treated rat was lower (P0.01), and the level of activities of SOD was higher (P0.01) than IR group. Also the Mel-treated ra
5、ts pathological change showed significant improvement during 24h after reperfusion. Conclusion Melatonin can protect renal function and tissue structure of IR injury through improving the activities of antioxidase and decreasing tissue lipid peroxidation.Key words Melatonin ischemia/reperfusion inju
6、ry superoxide dismutase malondialdehyde2了解肾缺血再灌注损伤（ IRI） 的发病机制及寻找更多更有效的药物防治肾IRI，是本学科领域的一个重要问题。本实验试图了解当肾脏发生缺血再灌注损伤时褪黑素对其的保护机制。1 材料与方法1.1 材料褪黑素(Mel)购自美国 Sigma 公司， BUN、Cr、SOD、MDA、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 雄性 SD 大鼠 30 只，体重 240260 g，由郑州大学医学院实验动物中心提供。1.2 方法1.2.1 建立大鼠肾缺血再灌注损伤模型：用 5%戊巴比妥钠麻醉大鼠（45mg/kg，腹腔注射）
7、。固定，常规消毒手术区，铺巾。正中剖腹，钝性分离左、右侧肾蒂，用无创动脉夹夹闭左侧肾蒂 45 min 后松开动脉夹实行再灌注，并结扎切除右肾。松开左侧动脉夹，5 min 内肉眼观测，若左侧肾灌注后颜色由暗黑转为红润，表示灌注成功，缝合切口。褪黑素先用无水乙醇溶解，然后用生理盐水将乙醇浓度稀释为5%。1.2.2 动物分组及处理：大鼠适应性饲养 5 天后分组。动物随机分为 3 组（每组 10只），Mel+肾缺血再灌注组（Mel+IR 组），即在缺血前 20 min 腹腔注射褪黑素溶液（10mg/kg），余同前述；肾缺血再灌注组（IR 组），即在缺血前 20 min 腹腔注射等量 5%酒精生理盐水，
8、余同前述；假手术组（Sham 组），即仅游离左侧肾蒂，但不钳夹，缺血前 20 min 腹腔注射等量 5%酒精生理盐水。1.2.3 观测指标及检测方法：于手术 24 h 时行腹腔麻醉后从眼眶静脉丛采血，静3置，离心留取血清标本行尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）检测；然后开腹取左侧肾脏，选择固定位置取肾组织制备组织匀浆行 SOD、MDA 检测；剩余组织置于 10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，切片，行 HE 染色后于光镜下观察肾组织病理变化。每张切片在高倍镜下取外髓皮质 10 个视野, 正常为 0 分; 受损肾小管 5%为1 分; 5% 25%为 2 分; 25%75%为 3 分; 75%为 4 分
9、。以此半定量分析并计算其均值1。BUN、Cr、SOD 、MDA 检测方法均严格按照产品说明书进行。1.3 统计学处理实验数据采用 SPSS11.5 统计学软件分析，以 xS 表示，组间均数比较采用单因素方差分析、LSD 检验。2 结果2.1 Mel 对肾缺血再灌注损伤大鼠血清 BUN、Cr 的影响与 Sham 组大鼠相比，IR 组大鼠 BUN 和 Cr 的水平明显升高（P0.01）, Mel+IR组大鼠 BUN 和 Cr 的水平比 IR 组大鼠 BUN 和 Cr 的水平明显降低（P0.01），但仍高于 Sham 组的水平（P0.01），结果见表 1。表 1Mel 对肾缺血再灌注损伤大鼠血清 B
10、UN、Cr 的影响 注：与假手术组比较 P0.01；与 IR 组比较P0.01 . 2.2 Mel 对肾缺血再灌注损伤大鼠肾组织匀浆 MDA 含量及 SOD 活性的影响与 Sham 组相比，IR 组大鼠肾组织匀浆 MDA 含量明显升高，而 SOD 的活性则明显降低（P0.01）。Mel+IR 组大鼠肾组织匀浆 MDA 含量较 IR 组有所降低（P0.05），但高于假手术组（P0.01）；Mel+IR 组大鼠肾组织匀浆 SOD 含量4较 IR 组有所升高（P0.01），但低于假手术组（P0.05），结果见表 2。表 2 各组大鼠肾组织匀浆 SOD、MDA 变化情况注：与假手术组比较 P0.01；
11、与 IR组比较 P0.05.2.3 病理组织学检查结果Sham 组大鼠肾近曲小管上皮细胞呈不同程度水肿，从肾被膜到肾髓质进行观察呈轻度到中度的变化，可见嗜酸性变的曲管上皮细胞，偶见管型，几乎不见凋亡细胞；IR 组近曲小管上皮细胞水肿明显，胞浆内含空泡的细胞增多，蛋白管型很多，嗜酸性变的曲管上皮细胞明显增多，髓放线和皮髓交界处易见凋亡细胞，并可找到凋亡小体；Mel +IR 组肾小管形态尚可，蛋白管型较 Sham 组增多，皮髓交界处可见凋亡细胞。对大鼠肾小管损伤进行半定量评分，并计算各组均值，IR 组与 Sham 组比较，Mel +IR 组与 IR 组比较差异具有统计学意义（P0.01），结果见表
12、 3。表 3 各组大鼠肾小管评分结果注: 与假手术组比较 p0.01；与 IR 组比较 p0.01.3 讨论肾脏缺血再灌注损伤涉及氧自由基的产生、钙超载、中性粒细胞浸润、细胞凋亡以及血管内皮损伤等多种病理生理学过程，机制十分复杂。肾脏为高灌注器官，对缺血及缺血后再灌注均较敏感2。本实验结果显示肾脏 IR24h 后,血浆 SOD 活性显著下降,MDA 含量显著升高,表明缺血再灌注损伤时由于肾细胞线粒体缺氧致 SOD 活力下降，使肾组织氧自由基清除能力下降,进一步导致脂质过氧化增加。脂质和蛋白质过氧化,尤其是使胞5膜上多价不饱和脂肪酸过氧化,损伤细胞膜和细胞器膜,可导致组织结构和功能受损3 ,脂肪
13、酸过氧化可生成丙二醛,它的生成与脂质过氧化相平行,因此,再灌注后血浆 MDA 含量明显增加，最终导致肾组织损伤。在本实验中，我们从 HE 光镜下观察发现，肾脏 IR 损伤是以皮髓交界处的肾小管上皮细胞损伤为主，表现为近曲小管上皮细胞水肿，空泡变性，嗜酸性变，蛋白管型增多以及肾小管坏死和细胞凋亡等。这些结构上的损伤在肾脏功能上的表现为体内的代谢产物 BUN、Cr 不能及时被清除而在血液中堆积。因此，我们认为在肾缺血再灌注损伤的病理过程中氧化侵袭起重要作用。近年研究表明 Mel 是迄今为止发现的最强最有效的自由基清除剂。它既可以发挥本身的自由基清除剂作用,直接清除羟自由基(OH) 、超氧阴离子(O
14、2- ) 、单线态氧（1O2）、过氧亚硝酸阴离子(ONOO-) ,又可以提高具有自由基清除作用的酶的活性,它清除羟自由基作用比常规羟自由基清除剂 benzoate 强 500 倍4。氧自由基具有强烈引发脂质过氧化作用，在缺血/再灌注条件下，可引发链式脂质过氧化反应损伤细胞膜，导致缺血/再灌注损伤。Mel 能提高抗氧化酶的活性，清除氧自由基发挥对肾脏 IR 损伤的保护作用，该作用在我们的实验中已明确。另外，我们在研究中发现应用 Mel 组的大鼠肾脏细胞凋亡较 IRI 组减少，肾组织 Bcl-2 蛋白表达显著增加（P0.01）,提示 Mel 通过凋亡蛋白 Bcl-2 影响肾脏凋亡的发生，发挥对肾脏
15、 IRI 的保护作用。Mel 可作为抗炎剂,通过对促炎和抗炎细胞因子水平的调节,发挥局部或全身性的抗炎作用5；抑制缺血/再灌注损伤后期的多种细胞因子（如 ICAM-1 及 P 选择素）作用于缺血组织中的中性粒细胞，抑制中性粒细胞激活爆发，从而减少自由基的生成，间接的发挥抗氧化作用。我们猜测这也是 Mel发挥肾缺血再灌注损伤的保护作用的机制之一。另外，Mel 还可以可降低细胞内6钙离子浓度，减轻缺血/再灌注损伤脏器受损伤的程度。Mel 受体可能在 Mel 的抗缺血再灌注损伤中发挥重要作用6 。总之，Mel 作为一种新型高效抗氧化剂和自由基清除剂,近年来被逐渐应用于多种组织器官缺血再灌注损伤的研究
16、并初步显示出令人鼓舞的结果。本实验结果显示 Mel 能保护肾小管上皮细胞，减轻缺血再灌注损伤对肾脏功能和结构的损伤，对肾缺血再灌注损伤有明显的保护作用,其作用机制可能为通过降低体内的氧化应激反应，提高抗氧化酶活性，增强清除自由基的能力，抑制脂质过氧化反应和凋亡的发生而发挥作用。【参考文献】1 Furuichi K, Wada T, Iwata Y,et al. A dministration of FR167653, a new anti- inflammatory compound, prevents renal ischemia/reperfusion injury in miceJ. Nephrol Dial Transplant,2002,17:399-4042 薛福平,李荣山. 中华眼镜蛇毒抑制肾缺血再灌注损伤的实验研究. 中华肾脏病杂志,2005 ,21(8):483-4863 Aksoy Y,Yapanoglu T ,Aksou H,et al. The effect of de
