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1、1ClC3 在人肺癌中的表达及分布作者：王丙清，宋立强，吴昌归 【Abstract】 AIM: To investigate the expression and biological significance of CIC 3 in pulmonary carcinoma. METHODS: The expression of CIC 3 in pulmonary carcinoma samples from 76 patients with lung cancer was detected by immunohistochemistry. RESULTS: There were 69 sa
2、mples (90.8%) with positive response in 76 lung cancer samples. No sample was positive in normal control group(n=10). CIC 3 was mainly located in the membrance and plasma of oncocytes and capillary endothelial cells. The expression of CIC 3 rose as TNM stage of cancer stepped up. CONCLUSION: CIC 3 e
3、xpresses commonly in pulmonary carcinoma and its metastasis, which may be related to TNM staging. 【Keywords】 pulmonary carcinoma;CIC 3 protein; immunohistochemistry; chloride channel 【摘要】 目的： 探讨 ClC 3 在人肺癌组织中的表达及其生物学意义. 方法： 应用免疫组织化学染色技术检测 76 例人肺癌标本中 ClC 3 蛋白的表达. 结果： 76 例人肺癌标本中阳性表达 69 例（90.8），对照组 10
4、例正常肺组织 ClC 3 蛋白的表达为阴性;而蛋白表达阳性的 69 例肺癌中,ClC 3 主要位于瘤细胞和微血管内皮细胞的胞浆内或细胞膜上. 随着 TNM 分期升级，ClC 3 蛋白表达也呈逐渐上调趋势（P0.01）. 结论： ClC 3 在人肺癌及肺转移癌组织中普遍表达,并且可能与肺癌 TNM 分期相关. 【关键词】 肺癌；蛋白质 ClC 3；免疫化学；氯化物通道 0 引言 肺癌是人体内最常见的恶性肿瘤之一,其突出的病理学特征是浸润临近肺组织和发生远处转移，使治疗失败或复发. 因此,弄清肺癌细胞的浸润机制,寻求有效的治疗措施,是当前临床和基础研究的重要课题. 肺癌细胞浸润过程涉及许多因素,其
5、中由 Cl 通道(chloride channel) 介导的细胞形状容积改变赋予细胞的“主动”浸润潜能学说近年来很受关注. ClC 3 是一种电压门控 Cl 通道,主要分布于细胞内2细胞器的脂膜中. 近年研究认为,ClC 3 参与调节性容积回缩(regulatory volume decrease, RVD) ,可能参与肺癌细胞的调节性体积改变,进而促进肿瘤细胞的增殖、浸润过程;但详细作用机制和特点尚未阐明. ClC 3 蛋白在我国肺癌患者的分布和表达规律也缺乏研究资料. 本研究我们采用免疫组化染色法，观察 CLC 3 在人肺癌标本（包括腺癌、鳞癌、大细胞癌、胸膜转移癌）中的表达情况，及其与肺
6、癌患者年龄、性别、分期及转移情况的关系，探讨其与肺癌发生发展的关系. 1 对象和方法 1.1 对象西京医院 2005 05/2006 06 经皮肺穿刺活检标本 76 （男 49,女 27） 例,年龄 2653（平均 36.6 ）岁. 所用标本均经常规病理检查证实，其中腺癌期 5 例，鳞癌期 3 例，大细胞癌期 4 例，腺癌级 29 例， 鳞癌级 12 例，肺转移低分化鳞癌 7 例及肺转移性腺癌 16 例;10 例正常肺组织切片作为对照. 所有石蜡标本作 4 m 厚的连续切片. Trizol 试剂(购自 Invitrogen 公司) ;ClC 3 抗体(购自 Santa Cruz 公司) ;免疫
7、组化超敏 UltrasensitiveTMS P 试剂盒,DAB 显色试剂盒均购自福州迈新公司. 人肺腺癌 A549 细胞系由上海医药工业研究所惠赠；IMP 2 型倒置生物学显微镜购自日本 OIympus 公司. 1.2 方法免疫组化 SP 染色检查 ClC 3 的蛋白表达. 空白对照采用 PBS 代替一抗. 结果判断： 每张切片均有 2 位病理科专家分别随机观察具有代表性的 10个高倍视野，根据胞膜和胞浆颜色程度及染色细胞的百分率（）进行评分，基本不着色 0 分，着色淡者为 1 分，着色适中者为 2 分，着色深者为 3 分，着色细胞占计数细胞百分率5为 0 分，625为 1 分，2550为
8、2 分，51%为 3 分，将每张切片着色程度得分与细胞百分率的分相乘为其最后得分，01 为阴性（-），23 为弱阳性（），4 为强阳性（ ）. 正常肺组织及不同分期肺癌 ClC 3 阳性染3色的例数百分数为阳性率. 统计学处理： 阳性率用%表示,组间比较应用 SPSS11.0 软件进行检验. 2 结果 2.1 肺癌中 ClC 3 蛋白的表达 ClC 3 蛋白主要表达在癌细胞和微血管内皮细胞的胞质或胞膜上(图 1) . 在 10 例正常肺组织中 ClC 3 表达阴性. 在 76 例肺癌标本中 69 例 ClC 3 表达阳性（90.8），强阳性 43 例（56.6），弱阳性 26 例（34.2）,
9、阴性 7 例（9.2），ClC 3 蛋白表达与性别、年龄及组织学分型未见一定关系（P0.05）. A：正常肺组织；B：肺腺癌期；C： 肺鳞癌期；D： 肺腺癌期；E： 肺转移性鳞癌. 图 1 肺癌中 CLC 3 蛋白的表达400（略） 2.2ClC 3 蛋白表达与肺癌临床病理关系 ClC 3 蛋白表达与肺癌的特征有一定关系（表 1）. 表 1ClC 3 蛋白表达与肺癌关系（略） 3 讨论 肿瘤侵袭转移是一个序贯、复杂的过程，包括肿瘤细胞脱离原发灶、黏附基底膜和细胞基质，并对其水解破坏，癌细胞侵入周围脉管，继续生长形成转移癌，肿瘤侵袭序贯于转移全过程，控制侵袭是抑制转移的关键，肺与其它全身恶性肿瘤
10、就发生的分子机制而言具有很多相同的特点,但同时也具有其独特性. 首先,它在肺内弥漫浸润,且很快有肺外转移;其次，瘤细胞的浸润可视为一个“主动”运动过程,即具浸润潜能的瘤细胞要有特殊的适应性改变以完成转移和浸润,其中就包括瘤细胞容积和形状的改变. 此外,腺癌常伴有明显的瘤周水肿腔液形成,而毗邻水肿区的肿瘤细胞并没有发生明显膨胀. 有研究证实低渗环境下,腺癌细胞仅可实现容积的部分恢复,而鳞癌细胞可调节细胞回复原有的或甚至更小的容积,说明与正4常肺组织细胞相比,肺癌细胞具有强有力的机制来调控细胞大小以保持其旺盛的生存能力. 细胞的调节性体积改变包括调节性细胞容积增大(regulatory volum
11、e increase, RVI) 和调节性细胞容积回缩(RVD) . 其中,RVD 是当细胞暴露于低渗环境时,细胞膨胀,该膨胀会激活细胞的调节机制,使已增大的细胞容积减小并向正常体积转变. RVD 被认为是与细胞的增殖、分化、迁移及细胞的凋亡密切相关的生理功能之一. 国内已有文章报道在鼻咽癌细胞中,Cl 通道(特别是容积调控性 Cl 通道) 通过 RVD 参与了细胞增殖、侵袭及转移1-2. ClC 3 属 Cl 离子通道家族中 亚族,ClC 3 可能是容量调节性 Cl 通道的分子基础3-5,参与 RVD 过程6-7. Soroceanu 等和 Ransom 等分别证实,用 Cl 通道抑制剂能够
12、阻止肿瘤的侵袭;还有学者发现 ClC 2 及 ClC 3 在多株恶性肺癌细胞膜上的表达明显上调,提示腺癌细胞可能具有更强的 Cl 转运能力,进而使细胞发生快速变形以增加其分裂增殖及浸润潜能. 本研究结果表明人肺癌及其它肺转移癌手术标本中 ClC 3 蛋白及 mRNA 普遍表达,而在正常肺组织中几乎未见表达. 提示 ClC 3 可能与肺癌细胞的容积调控、增殖及浸润转移有关;腺癌细胞瘤期 ClC 3 蛋白及 mRNA 的表达均明显高于其级,提示 ClC 3 的表达可能与腺癌的病理分级相关. 因此,研究 Cl 通道在肺癌中的作用,有助于进一步了解肺癌细胞的生物学特性. 【参考文献】 1 陈丽新，王立
13、伟，Tim JacobCl. 在鼻咽癌细胞调节性容积回缩中的作用J. 中国病理生理杂志, 2002, 18(5):490-493. 2 王立伟，陈丽新，朱林燕. 抑制氯通道阻抑鼻咽癌细胞周期和细胞增殖J. 中国病理生理杂志, 2004,20(5):715-718. 53 Yoshikawa M, Uchida S , Ezaki J , et al. ClC 3 deficiency leads to phenotypes similar to human neuronal ceroid lipofusci nosisJ. Genes Cells, 2002,7(6):597-605. 4 Y
14、amamoto Mizuma S, Wang GX, Liu LL , et al. Altered properties of volume sensitive osmolyte and anion channels (VSOACs) and membrane protein expression in cardiac and smooth muscle myocytes from Clcn3 / mice J. J Physiol, 2004,557(Pt 2):439-456. 5 Okada Y, Maeno E. Apoptosis, cell volume regulation a
15、nd volume regulatory chloride channels J. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol, 2001,130(3):377-383. 6 Hermoso M, satterwhite Cm , Andrade YN , et al. ClC 3 is a fundamental molecular component of volume sensitive outwardly rectifying Cl channels and volume regulation in Hela cells and Xenopus laevis oocytesJ. J Biol Chem, 2002,277(42): 40066-40074. 7 von Weikersthal SF, Barrand MA, Hladky SB. Functional and molecular characterization of a volume sensitive chloride current in rat brain endothelial cellsJ. J Physiol, 1999,516(Pt 1):75-84.
