《rhG-CSF对健康供者外周血和骨髓免疫特性影响的比较》由会员分享，可在线阅读，更多相关《rhG-CSF对健康供者外周血和骨髓免疫特性影响的比较（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1rhG-CSF 对健康供者外周血和骨髓免疫 特性影响的比较作者：赵翔宇，常英军，黄晓军 【摘要】 本研究探讨 rhG-CSF 对健康供者外周血采集物（G-PB）和骨髓采集物（G-BM）免疫学特性影响的异同。用 MTT 法和夹心酶联免疫复合物（ELISA）法检测 G-PB 和 G-BM 中 T 淋巴细胞增殖能力和 IL-4、IFN- 的分泌，并用流式细胞术测定两种移植物的 T 细胞亚群、树突状细胞（DC）亚群、单核细胞及共刺激分子CD28 的表达。结果表明： G-PB 中淋巴细胞，CD3+、CD4+、CD8+ T 淋巴细胞，DC1、DC2 以及单核细胞的含量，CD4/CD8 的比值高于 G-B
2、M（P0.001）。G-PB的 T 淋巴细胞增殖能力高于 G-BM（P0.05）；每微升 G-PB 移植物中 T 淋巴细胞分泌细胞因子 IFN-、IL-4 的量均明显高于 G-BM，且 G-PB 中 IL-4/IFN- 比值小于 G-BM（P0 001），DC2 与 T 淋巴细胞的比值也低于 G-BM（P0.01）；而 G-PB 中 CD4+、CD8+细胞上 CD28 表达的百分比和总体表达均高于 G-BM（P0 001）。结论： rhG-CSF 体内应用诱导 G-PB 和 G-BM 产生的 T 细胞免疫低反应性是有差异的，而两者之间的差异是 G-PB 和 G-BM 移植后移植物抗宿主病（GV
3、HD）发生率和程度不同的免疫学基础。 【关键词】 粒细胞集落刺激因子；外周血移植物；骨髓移植物；共刺激分子；免疫低反应性Effects of rhG-CSF Mobilization on Immunological Properties of Grafts from Peripheral Blood and Bone Marrow2Abstract This study was aimed to investigate the difference of immunological properties between recombination human granulocyte colo
4、ny-stimulating factor (rhG- CSF) mobilized peripheral blood grafts (G-PB) and rhG-CSF primed bone marrow grafts (G-BM).The lymphocyte proliferation ability and the quantities of interleukin-4 (IL-4) and interfe-ron- (IFN-) secreted by T cells were determined by using MTT assays and sandwich ELISA; T
5、 cell subgroups，dendritic cells (DC)，monocytes and the expression of CD28 costimulatory molecules on T cells were determined by multicolor flow cytometry. The results showed that the absolute numbers of lymphocytes，monocytes，CD3+，CD4+ and CD8+ T cells as well as DC1 and DC2，the ratios of CD4/CD8 in
6、G-PB were significantly higher than those in G- BM，respectively (P0.001). T cell proliferation ability was significantly higher in G- PB than that in G-BM (P0.05). The quantities of IFN- and IL-4 secreted by T cells per micromilter of G-PB was significantly higher than those of G-BM，the ratios of IL
7、- 4/IFN- were significantly lower in G-PB than that in G-BM (P0.001). As compared with G-BM，the ratio between DC2 and T-lymphocyte was significantly low in G-PB (P0.01)，whereas the percentage and overall expression of CD28 on CD4+ and CD8+ cells were significantly high in G-PB (P0.05). It is conclud
8、ed that T cell hyporesponsivenesses of G-PB and G-BM induced by rhG-CSF in vivo were confirmed to be different，and the difference of immunological properties between G- PB and G-BM may explain the lower incidence of GVHD and lower relapse after G- BM and G-PB transplantation respectively.Key words g
9、ranulocyte colony-stimulating factor; peripheral blood stem cell graft; bone marrow graft; immunohy-poresponsiveness; costimulatory molecules我们的实验结果表明，与未动员的外周血相比，rhG-CSF 体内应用诱导外周血采集物（G-PB）T 细胞产生了免疫低反应性，促使 Th1 型细胞向 Th2 型细胞极化，并改变了外周血采集物中单核细胞和树突状细胞（DC）等的免疫组成1，2；随后我们又以静态的骨髓为对照，研究发现 rhG-CSF 体内应用同样也部分改变了骨
10、髓采集物（G-BM）的免疫细胞组成，诱导骨髓移植物 T 细胞免疫低反应性、促使 Th1型细胞向 Th2 型细胞极化3。上述研究为 G-PB/G-BM 混合移植提供了理论依据1-5。最近，随机临床研究证实，G-BM 移植较 G-PB 移植具有移植物抗宿主病（GVHD）发生率低、免疫抑制剂应用期短等优势6。因此我们推测，rhG-CSF 体内应用可能对健康供者外周血采集物和骨髓采集物免疫特性的影响存在差异，而这些差异的阐明将对干细胞来源的选择和个体化移植的开展具有重要意义。为此，3我们研究了 G-PB 和 G-BM 在免疫学特性方面的异同。材料和方法材料标本来自 2003 年 410 月在我院接受异
11、基因造血干细胞移植的 15 名亲缘供者，男 8 名，女 7 名，中位年龄 40 岁（13 岁-65 岁）。皮下注射 rhG-CSF 5 g/(kgd)，连续 5 天，在第 4 天按照我院常规采集骨髓输注给患者，同时留取肝素抗凝的骨髓采集物 10 ml，第 5 天留取外周血采集物 2 ml，各取 0.5 ml-1 ml 行活细胞免疫荧光标记；用淋巴细胞分离液分离单个核细胞（MNC），常规记数，台盼蓝活细胞染色拒染率在 98%以上，以含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液（Gibco 公司产品）调整细胞浓度为 5106/ml 备用。免疫荧光标记抗体均购自 Becton Dickinson
12、 公司（表 1）；植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA），四甲基偶氮唑盐（monotetrazolium，MTT），盐酸十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）均为 Sigma 公司产品；夹心 ELISA 试剂盒购自深圳晶美生物技术公司。Table 1. Combinations of fluorochrome-labeled monoclonal antibodies (McAb) used for flow cytometry determination（略）流式细胞术检测采用三色或四色荧光标记技术，抗体组合见表 1，活细胞膜抗原直接标记法
13、参见文献1。每管取 G-BM 100 l 或 G-PB 30 l，分别加入表 1 中所示各种抗体，4避光孵育 15 分钟；加溶血素 2 ml 室温避光 10 分钟，溶解红细胞， ；然后 200g离心 5 分钟，弃上清，用 PBS 将标记细胞洗涤 2 次；加入含 1%多聚甲醛 PBS 200 l，固定后 24 小时内上流式细胞仪检测。4流式细胞仪测定结果分析用 Cellquest 软件（Becton Dickinson 公司的 FACSsort 型流式细胞仪）分析。T淋巴细胞亚群和 DC 亚群分析以及 CD28 测定参见文献3。用 FSC/SSC 设门画出淋巴细胞群（R1），二维点图显示 R1
14、内细胞，设 CD3 阳性细胞群为 R2，在 R2内分别显示 CD4/CD8、CD3/CD28、CD4/CD28、CD8/CD28 二维点图，分析CD3+、CD4+、CD8+细胞的比例以及这些细胞上 CD28 表达的百分比和荧光强度，并计算 CD8+CD28-抑制性 T 细胞占有核细胞的比例。DC 细胞为 Lineage，包括 CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD34、CD56 均阴性，HLA-DR 阳性的细胞。进一步根据 CD11C 的表达将 DC 分为 CD11C+（即 DC1）、CD11C-（即 DC2），并计算 DC、DC1 以及 DC2 占有核细胞的百分比。T 细胞增殖
15、能力测定将 PBMNC 或 BMMNC 接种在 96 孔板中，每孔 100 l，含 105 细胞，设复孔3 个，与终浓度为 10 g/ml 的植物血凝素（PHA）共同孵育 72 小时，同时设对照孔（不加 PHA），最后 4 小时加入 10 l 四甲基偶氮唑盐（MTT，5 mg/ml），用 100 l 0.1%盐酸十二烷基硫酸钠（SDS）终止过夜，570 nm 酶标仪读取 OD 值3。刺激指数（SI）=PHA 刺激孔 OD 值/对照孔 OD 值夹心 ELISA 测定细胞因子 标本制备：将 PBMNC 或 BMMNC 接种于 24 孔板中，每孔含 T 细胞 1106，设 3 个复孔，与终浓度为 1
16、0 g/ml 的 PHA 共同孵育 48 小时，离心收集上清液，5分装后置-30冰箱保存待测。IL-4 和 IFN- 采用夹心 ELISA 方法测定，严格按照产品说明书操作3。每微升 G-PB 和 G-BM 中所含的 MNC 产生的型细胞因子（IFN-）以及型细胞因子（IL-4）的数量由计算所得，计算公式为：或型细胞因子的量 = 细胞因子的产量（pg/106 MNC）细胞数（MNC/l）统计学处理所有数据均采用均数标准差（XSD）表示，应用独立样本 t 检验，SPSS 10.0统计软件进行分析。结果G-PB 和 G-BM 中 T 淋巴细胞功能的对比G-PB 的 T 细胞增殖能力（1.130.24）明显高于 G-BM（0.980.24）（P0.05）；每微升 G-PB 所含 T 细胞产生的 IFN- （13.1914.33）pg vs（1.130.57）pg，P0.001和 IL-4 的数量（3.671.77）pg
