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1、1新型神经支架材料的构建及其与骨髓基 质干细胞复合的实验研究作者：孟浩，罗卓荆，冯林杰，王亮【摘要】 目的研制出一种可用于修复周围神经缺损的组织工程支架材料，并观察体外培养的骨髓基质干细胞在支架材料中的生长情况。 方法以 I 型胶原蛋白和明胶通过冷冻干燥技术制备胶原蛋白支架材料。扫描电镜观察内部结构的排列规律及走行，测量其孔径大小、孔隙率等指标。将骨髓基质干细胞复合到胶原蛋白支架材料中共培养 5 d 后，扫描电镜下观察其在材料内部的生长情况。 结果构建的材料均为圆柱状，内部为孔径均匀且平行排列的微管结构，体外培养的骨髓基质干细胞成功种植在支架材料上，在材料内部生长良好。 结论构建的支架材料具有
2、良好的三维空间构形和生物相容性，为神经损伤的修复提供了一种新型的支架材料。 【关键词】 组织工程; 胶原； 明胶； 骨髓基质干细胞周围神经缺损的修复一直是神经科学的一大难题，自体神经移植是临床上修复神经缺损常用的方法，但是，由于其存在增加一次手术、造成供区神经功能丧失、供受区神经不匹配等不足，应用受到了限制。人们用导管修复神经缺损已经有100 多年的历史，近年来组织工程的发展为神经缺损的修复提供了可能，作者以胶原蛋白为主要原料制备了具有轴向微管结构的组织工程支架材料1，并将其与骨髓基质干细胞(BMSCs)复合，观察支架材料的生物相容性。21 材料与方法1.1 胶原蛋白支架材料的制备分别称取 I
3、 型胶原蛋白(Sigma C9879)150 mg，明胶(Sigma G9382)75 mg，溶于0.05 mol/L 醋酸溶液中，在恒温 4条件下，18 000 rmin 搅拌 90 min，负压抽真空后，4冰箱过夜，充分混合成凝胶状悬浊液，将悬浊液注入内径 3 mm，长 10 cm 的硅胶管中，密封两端，顺轴向用自制微型调速仪以 210-5 ms 的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40，100 mtorr 条件中冻干 48 h，即可制得干燥成形的胶原蛋白支架材料2。支架材料用戊二醛交联，CO60 消毒密封备用3。1.2 支架材料内部扫描电镜观察将上述方法制备的
4、支架材料喷金镀膜，以扫描电镜观察其横截面、纵截面及材料外表面，并测量材料微孔的直径。1.3 支架材料孔隙率的测量把已知重量 W1，体积 V的材料浸入装有水的密闭容器中，采用负压抽吸的方法排除材料孔隙内的空气，此时材料内部充满水，将材料取出，吸干表面的液体，称重为 W2。W2-W1(水的比重为 1)，得 V即为材料的孔隙体积，V1V0 即可得出材料的孔隙率。1.4 骨髓基质干细胞的分离、培养断颈处死 SD 大鼠，取双侧股骨，暴露出骨髓腔，培养液冲洗骨髓腔 23 次，3将所获的冲洗液过滤，然后加入相同体积的 0.84NH4CL 溶液4。850 r/min 离心 10 min 后弃去上清，培养液(D
5、MEMF12+15FCS)稀释后制成单细胞悬液，接种于培养瓶内，于 37、5C2 的培养箱中培养，72 h 后换液除去未贴壁细胞，以后每周换液 3 次，当细胞生长达 85融合时，用 0.25胰蛋白酶消化传代培养5。1.5 骨髓基质干细胞与支架材料的复合将培养的 BMSCs 胰酶消化后，制成单细胞悬液，将 BMSCs 悬液以110ml 的密度用微量注射器分别注入 10 根 4 cm 的支架材料内，然后将材料置于骨髓基质干细胞培养基中培养，隔天换液，共培养 5 d 后，将支架材料取出，固定、干燥、喷金镀膜，扫描电镜下观察细胞在支架材料内的生长情况。 2 结果2.1 支架材料的构建作者通过冷冻干燥技
6、术制备了新型的周围神经组织工程支架材料(图 1)，可以根据需要，制备成不同的外形和长度，作者所制备的桥接材料均为圆柱状；经物镜及电镜观察外表面为封闭结构，扫描电镜观察横切面显示微管内径较均一(图 2)，其内部为轴向平行排列的微管结构(图 3)，孔径在 20m80 m，与坐骨神经结构相似，从而为神经纤维再生提供了通道。作者随机选取 20 根已称重 W的材料，测量其截面直径、长度，计算出体积 V0，按照上述方法称重 W2，通过公式计算出孔隙率为 81.5。2.2 BMSCs 的分离、培养BMSCs 接种后 48 h 开始贴壁伸展生长，大多数呈梭形，可见细胞团落形成，4初次换液后，细胞迅速增殖生长，
7、当细胞生长达到 85融合时，传代接种培养，通过传代换液除去未贴壁细胞来纯化 BMSCs。当传至第 3 代时，BMSCs 形态较一致，呈梭形生长，折光性较强(图 4)。2.3 扫描电镜观察结果BMSCs 注入支架材料并共培养 5 d 后，见有大量的 BMSCs 在支架材料内部贴附，细胞突起整合于支架材料内壁，且生长良好(图 5、6)。3 讨论近年来，应用组织工程技术构建具有良好生物相容性的支架材料修复外周神经损伤成为研究的热点。应用神经修复导管桥接两神经断端，引导神经轴突轴向生长，避免外生和形成神经瘤，为神经再生提供一个相对隔绝的微环境，可修复周围神经节段的缺损。目前神经组织工程支架材料主要分为
8、天然材料(血管，胶原等)和合成材料(PLA、PGA 等)，PLA、PGA 在降解过程中降低了 pH 值，而 pH 值的降低可加速材料的自身催化降解，结果在材料周围将形成一个强酸环境，严重影响了细胞的功能，以天然的细胞外基质为原料制备支架材料成了研究的新方向，胶原蛋白和明胶是细胞外基质的主要成分，胶原蛋白不仅对细胞具有趋化作用，而且还具有促进细胞黏附、增殖，无免疫原性，降解产物对细胞无毒性等优点。并可参与组织愈合过程，在烧伤创面敷料、组织再生诱导方面得到广泛应用，应用在神经导管中能刺激改善周围神经的再生6。作者以 I 型胶原和明胶为主要原料，通过冷冻干燥技术制备了具有轴向微管排列结构的神经支架材
9、料，微管直径在2080 m，使其不仅在组成成份上，更在三维结构上高度仿生神经。这种轴向排列的微管结构，有利于引导再生轴突定向生长，材料的外表面为致密结构，可有效5阻止体内纤维结缔组织的长入。有研究报道，BMSCs 在周围神经损伤的修复中能够有效的促进轴突的再生，本实验表明，BMSCs 种植在支架材料并共培养后，有大量的细胞在支架材料内部黏附，生长良好，发出的伪足长入支架材料内，支架材料具有良好的生物相容性。综上所述，作者制备的胶原蛋白支架材料，为周围神经损伤的修复开辟了一条新的途径，具有良好的应用前景。【参考文献】1 Chamberlain LJ,Yannas IV,Hsu HP,et alC
10、ollagen GAG substrate enhances the quality of nerve regeneration through collagen tubes up to level of autograftJExp Neurol,1998,154：315-3292 梁伟，罗卓荆，王树森，等修复神经缺损的组织工程支架材料的研制及其生物相容性研究J中华创伤骨科杂志,2004,6(9)：1037-10413 Etoh S,Takakuda K,Kawabata K,et alEvaluation of cross linking procedures of collagen tub
11、es used in peripheral nerve repairJBiomaterials,2002,23(23)：4475-44814 Ayman A，Takeshi K，Kazumasa E，et alMorphological differentiation of bone marrow stromal cells into neuron like cells after co culture with hippocampal sliceJBrain Res， 2004，1029(1)：114-1195 冯林杰，罗卓荆，王晓礽，等嗅鞘细胞条件培养液对骨髓基质干细胞的诱导分化作用研究J
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