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1、1银杏叶提取物对大鼠实验性结肠炎 COX2 表达的影响【摘要】 目的观察银杏叶提取物对结肠炎大鼠结肠组织环氧合酶2 (cyclooxygenase2, COX2)表达的影响。方法 应用三硝基苯磺酸(TNBS)灌肠制备大鼠实验性结肠炎模型。实验设正常对照组，三硝基苯磺酸模型组，阳性药物对照组(5ASA group ,100 mg/kg)，银杏叶提取物（EGB）组(200 mg/kg)4 组。评估大鼠结肠黏膜大体形态和组织学评分。免疫组化检测肠组织环氧合酶2（COX2）蛋白的表达。结果 与模型组相比，EGB 组结肠组织 COX2 表达明显减少，EGB能明显减轻大鼠实验性结肠炎模型组大体形态和组织学
2、评分。结论 EGB 可能通过抑制炎性细胞因子（TNF, NFBp65, IL6）的表达，从而抑制 COX2 生成，对大鼠实验性结肠炎具有保护作用。 【关键词】 银杏叶提取物；溃疡性结肠炎; 环氧合酶2ABSTRACT:Objective To study the influence of Ginkgo biloba extract(EGB) on the expression of cyclooxygenase2(COX2) in experimental colitis in rats. Methods Colitis in rats was induced by colonic admin
3、istration with 2,4,6trinitrobenzene sulfonic acid .The animals were divided into 4 groups: normal group, model group,5ASA (5aminosalicylic acid,100 mg/kg) group ,EGB (200 mg/kg) group. The macroscopical and histological changes of the colon were evaluated. Expression of COX2 in the colon tissues was
4、 detected by immunohistochemistry.Results The expression of COX2 of colon tissue in EGB group were obviously lower than those of model group. As compared with the model group, EGB notably reduced colon macroscopic and histological scores. Conclusion EGB could alleviate the inflammatory reactions in
5、colitis through inhibiting Inflammatory mediators (TNF-, NFBp65, IL6) and decreasing the generation of COX2.KEY WORDS:Ginkgo biloba extract; Ulcerative colitis; Cyclooxygenase2银杏叶提取物广泛用于治疗呼吸系统、心脑血管系统等疾病，有清除自由基和过2氧化脂质、调节循环系统、改善血液循环、拮抗血小板活化因子、保护组织等作用。环氧合酶2 (cyclooxygenase2, COX2)诱导产生 PGs(主要是 PGE2)是溃疡性
6、结肠炎（UC）炎症反应过程中的关键环节，阻断 COX2 的表达从而减少 PGs 生成可以控制 UC 炎症反应过程1。银杏叶提取物对溃疡性结肠炎 COX2 表达的影响，尚未见研究报道。我们在前期研究2的基础上，进一步观察 EGB 对大鼠实验性结肠炎 COX2 表达的影响，探讨 EGB 防治 UC 的可能机制。1 材料和方法1.1 材料雄性 Wistar 大鼠 40 只，体质量为 18020g，购自湖北省实验动物中心；2，4，6三硝基苯磺酸（2,4,6trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）购自 Sigma 公司；银杏叶提取物为贵州信邦制药股份有限公司提供；环氧合酶2
7、（COX2）多克隆抗体购自 Santa Cruz 公司；SP 试剂盒为北京中山生物制品公司产品。1.2 方法动物随机分为正常对照组（normal group），三硝基苯磺酸模型组（model group），阳性药物对照组（5aminosalicylic acid，5ASA group），EGB 组（EGB group）4 组，每组 10 只。造模前大鼠禁食不禁水 24 h。正常对照组以 500 mL/L 乙醇灌肠，其他组均以 TNBS 灌肠诱导实验性结肠炎形成。按文献3方法造模， TNBS（150 mg/kg）溶解于 500 ml/L 乙醇溶液缓慢推入结肠。造模 24 h 后 4 组分别予以生
8、理盐水 2 ml，5ASA100 mg/kg，EGB 200 mg/kg 灌胃治疗，每天 1 次连续 4 周。4 周后处死大鼠，分离结肠，沿肠系膜纵轴剪开，冷生理盐水冲洗干净，参照文献3标准进行肉眼大体形态损伤评分和镜下评价结肠组织学损伤评分。31.3 免疫组化检测肠组织 COX2 表达操作按照 SP 免疫组化染色试剂盒说明书进行。PBS 代替一抗作阴性对照。结果判断: 细胞呈棕黄色为阳性，表达于胞浆。每张切片计算任意 10 个高倍视野（200倍）中阳性细胞所占的百分比例。1.4 统计学处理 实验数据以s 表示，采用 SPSS11.5 软件进行统计学分析，两组间比较用单因素方差分析，组间差异采
9、用 q 检验。以 P0.05 为有统计学意义。2 结 果2.1 结肠大体形态和组织学评分大体形态评分：模型组肉眼观察到肠粘膜水肿、溃疡、点片状出血。EGB 组及 5ASA 组肠黏膜充血、水肿、糜烂情况显著改善（P0.01），见表 1。组织学损伤评分：三硝基苯磺酸模型组黏膜上皮坏死脱落，典型溃疡形成。EGB 组和 5ASA组以上病理组织表现明显好转（P0.01），见表 1。EGB 组较 5ASA 组好转更加明显( P0.05)，见表 1。表 1 各组大鼠大体形态、组织学评分和 COX2 表达的比较(略)与模型组比较，* P0 .01；与 5ASA 组比较， P0 .052.2 免疫组化染色结果正
10、常对照组 COX2 几乎不表达。模型组肠组织可见大量 COX2 阳性细胞，呈棕黄色颗粒，胞质着色，主要分布在黏膜及黏膜下层，较正常对照组表达明显升高4（P0.01）。EGB 和 5ASA 治疗后较模型组 COX2 表达明显下降（P0.01），EGB 组较 5ASA 组下降更加明显（P0.05）。见表 1。3 讨 论COX2 是炎症反应中催化前列腺素合成的一个关键诱导酶，在生理情况下很少表达，在病理情况下被诱导表达并参与炎症反应。许多刺激物如生长因子、炎性细胞因子（TNF, NFBp65, IL6）、花生四烯酸、肿瘤诱导剂等可刺激细胞的COX2 表达，而抗炎细胞因子及糖皮质激素则可抑制 COX2
11、 产生。越来越多的证据表明 COX2 及其诱导产生的 PGs 在炎症修复过程中发挥重要作用。花生四烯酸代谢异常是 IBD 致病的重要环节，作为花生四烯酸代谢生成重要炎症介质PGE2 的主要限速酶 COX2 在 IBD 肠组织中迅速大量增加，合成大量病理性PGE2。大量研究证实抑制花生四烯酸代谢过度可明显减轻 IBD 炎症损害。研究表明正常结肠黏膜绝大多数情况下不表达 COX2，炎症粘膜上皮细胞及结肠固有层单核炎性细胞表 COX2;在炎症活动期结肠固有层和肌间神经丛中 COX2 mRNA 表达水平明显高于非活动期4。COX2 的表达可以激活 NFkB，并形成正反馈自我调节环路，导致炎症级联和组织
12、损害，导致溃疡性结肠炎的发生和发展。本研究中实验性结肠炎大鼠模型组结肠组织 COX2 表达明显升高，提示花生四烯酸代谢过度，EGB 可明显减少其表达，有效缓解炎症反应，改善其病理损害，从而起到一定的治疗作用。银杏叶提取物具有抗氧化、抗炎、调节循环系统、改善血液循环、基因调节等作用。如前所述，COX2 作为炎症相关基因受 NF-KB 调控，抑制 NF-KB 可以抑制 COX2 启动子的活性。本课题组前期研究表明 EGB可能通过其抗氧化作用下调炎症介质（TNF, NFBp65, IL6），保护 TNBS 诱5导的溃疡性结肠炎2。我们推测 EGB 可能通过下调促炎细胞因子（TNF, NFBp65,
13、IL6）来抑制 COX2 的产生，对大鼠实验性结肠炎具有保护作用。【参考文献】1Fiocchi C. Inflammatory bowel disease : Etiology and pathogenesisJ.Gastroeanterology，1998，115(2): 1822 Zhou YH, Yu JP, Liu YF, et al. Effects of Ginkgo biloba extract on inflammatory mediators (SOD, MDA, TNFalpha, NFkappaBp65, IL6) in TNBSinduced colitis in ra
14、tsJ. Mediators Inflamm，2006，2006(5): 926423 Morris GP, Beck PL, Herridge MS,et al. Hapteninduced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon J. Gastroenterology, 1989，96:7954 Roberts PJ,Morgan K,Miller R,et al. Neuronal COX2 expression in human myenteric plexus in active inflammatory bowel disease J.Gut,2001，48(4):468
