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1、1 射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡 的影响作者：谷欣权 曹霞 孔祥波 马庆杰【摘要】 目的 探讨 射线内照射对人增生前列腺细胞凋亡的影响。方法 20 例前列腺增生(BPH)患者随机分为 4 组：对照组未行内照射，3 组照射组于前列腺切除术前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射线内照射，采用 TUNEL 染色、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳检测前列腺细胞凋亡变化。结果 与对照组比较， 射线内照射后前列腺细胞凋亡增多，并随时间延长而增加（P0.01），对照组基因组 DNA 保持完整， 射线辐射 7 d 后基因组 DNA 呈现梯状带凋亡改变。结论 射线内照射能够有效诱发人增生的前列腺细胞凋亡，进
2、而引起前列腺组织萎缩。 【关键词】 前列腺增生；电离辐射；细胞凋亡【Abstract】 Objective To investigate the effect of irradiation on cell apoptosis in human hyperplastic prostatic tissues. Methods 20 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) were divided into 4 groups according to the different time treated with 90Sr/90Y irrad
3、iation to prostatic hyperplasia applicator before prostatectomy or TURP. The cell apoptosis of human hyperplastic prostatic tissues was detected by TUNEL and flow cytometry and agarose gel electrophoresis.Results Compared with control group, the percentage of cell apoptosis arose after treated with
4、90Sr/90Y irradiation and grew more with time going (P0.01). DNA kept complete in control group while typical DNA ladder band appeared in DNA fragment electrophoresis and the positive cells that presented browed were observed in irradiation 7 group. Conclusions rays irradiation can efficiently induce
5、 cell apoptosis from human prostatic hyperplasia tissue and cause the atrophy of prostatic tissue.【Key words】 Benign prostatic hyperplasia；Radiation；Apoptosis细胞凋亡在前列腺增生（BPH）的发生、发展中具有关键性作用1，2。电离辐射2作为一种基因毒素，除了可使前列腺组织中与细胞凋亡相关的基因和细胞因子发生改变外，还能直接或间接引起 DNA 损伤而诱发凋亡3，4。本实验采用 TUNEL染色、流式细胞术（FCM）和琼脂糖凝胶电泳检测 射线内照
6、射对增生前列腺细胞凋亡的影响，为采用电离辐射治疗 BPH 提供实验依据。1 材料与方法1.1 实验分组 BPH 患者 20 例，年龄 5872 岁，病程 213 年，患者随机分为 4组，每组 5 例：3 个照射组于前列腺切除术前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射线内照射，照射剂量为 3050 Gy，对照组未行内照射。各组均行经尿道前列腺切除术或经膀胱前列腺摘除术获得前列腺标本。1.2 TUNEL 染色检测细胞凋亡 4%多聚甲醛固定前列腺组织 46 h，石蜡包埋。切片加蛋白酶 K 37消化 5 min，TBS 洗涤。加含有 TdT 和 DIGdUTP 的标记液 20 l/片，37标记 2
7、 h，TBS 洗涤 2 min3 次。加封闭液 50 l/片室温 30 min，加封闭液 1100 稀释生物素化抗地高辛抗体 50 l/片，37反应 30 min，TBS 洗涤。加 SABC 37反应 60 min，TBS 洗涤。DAB 显色 15 min，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。显微镜下凋亡阳性细胞核呈深浅不一的棕黄色，正常细胞核呈蓝色，在每张切片上随机选取 10 个高倍镜视野，计阳性细胞数和细胞总数，计算阳性反应细胞数占细胞总数的平均百分比。1.3 FCM 检测凋亡细胞 DNA 含量 新鲜组织研磨成单细胞，70%冷乙醇固定，4过夜。600 r/min 离心 5 min，弃上清，加
8、 0.01 mol/L PBS 5 ml，混匀 1 500 r/min离心，弃上清，反复 3 次。用 PBS 调整细胞浓度 106/ml，过 350 目滤网，制成单细胞悬液，加入浓度 200 g/ml 的 RNase A，37水浴 30 min，加入低渗荧光染料溶3液混匀，4避光染色 30 min。用流式细胞仪摄取 PI 荧光，测凋亡细胞核百分率。1.4 DNA 琼脂糖凝胶电泳 组织研碎后，离心去上清，加入 10 倍体积的 DNA 抽提液混匀，37水浴 1 h，加入蛋白酶 K，50水浴 3 h，12 000 r/min 离心 5 min，用饱和苯酚抽提上清 1 次，再用苯酚/氯仿/异丙醇（25
9、241）1ml 充分混匀，8 500 r/min 离心 5 min，弃酚相，保留上清，上清中加入 3 mol/L 醋酸钠和冷乙醇，-20沉淀过夜。-10 12 000 r/min 离心 10 min，将沉淀溶于 20 l TE 缓冲液，加入 1 l RNA 酶，37保温 1 h。加 4 l 样本缓冲液到含有 0.4 g/ml 溴化乙锭的 1%2%的琼脂糖凝胶的样品孔中，室温、恒流 75 mA，于 1TAE 缓冲液中电泳 12 h，紫外灯下观察实验结果。1.5 统计学处理 数据应用 SPSS11.5 统计软件进行统计学处理，组间比较采用 t检验。2 结 果2.1 TUNEL 法染色检测前列腺细胞
10、凋亡 对照组仅见少数散在的凋亡细胞，经90Sr/90Y 射线辐射后细胞凋亡增多，并随时间而逐渐增加。与间质细胞比较，腺上皮细胞凋亡更加明显，见图 1。2.2 FCM 检测凋亡细胞 DNA 含量 经流式细胞仪分析凋亡细胞的 DNA 含量，可见对照组凋亡细胞百分率为（1.740.35）%， 射线辐射可使前列腺组织细胞周期时相发生改变，在二倍体峰前出现亚二倍体峰即凋亡峰。随时间延长凋亡细胞逐渐增多，辐射 1、4、7 d 凋亡细胞百分率分别为(3.830.74)%，(5.661.72)%，(13.153.03)%，与对照组比较差异显著（P0.01）。42.3 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡 对照组
11、基因组 DNA 保持完整，经 射线辐射 7 d 后基因组 DNA 发生断裂，呈现典型的凋亡改变即 DNA 梯形带（DNA Ladder），表明 射线可使细胞核内 DNA 在核小体连接处发生断裂，形成180200 bp 及其整数倍的核苷酸片段，见图 2。图 1 TUNEL 染色检测前列腺组织中细胞凋亡(400)图 2 DNA 琼脂糖凝胶电泳 3 讨 论细胞凋亡涉及一系列基因表达、蛋白质和酶的激活，是细胞为了适应生存环境而主动采取的死亡方式，良性增生的前列腺组织中很少见到细胞的有丝分裂，DNA的合成也少于正常细胞，提示 BPH 的病因可能不是前列腺细胞的过度增殖引起，而是细胞凋亡减少所致5。细胞凋
12、亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞染色体 DNA 被切割，出现单链或双链缺口，并产生与 DNA 断点数目相同的 3OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶可将地高辛标记的 dUTP(DIGdUTP)标记至3OH 末端，DIGdUTP 结合在 DNA 断点部位，可以通过碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体反应后，加入显色底物予以显示。此种方法灵敏度很高，在凋亡早期就可以检测到 DNA 断裂。在本实验中，通过原位末端脱氧核糖核酸转移酶将地高辛标记的dUTP(DIGdUTP)标记至 DNA 断点部位，以显示细胞凋亡的程度，阳性细胞核呈棕黄色。实验结果可见对照组仅见极少数散在的凋亡细胞，经 90Sr/90Y 射线
13、辐射后凋亡细胞数量随时间延长而逐渐增多，与间质细胞比较，腺上皮细胞凋亡更加明显，说明辐射能使增生的前列腺细胞发生凋亡，而前列腺的腺上皮对于辐射5更加敏感6。前列腺细胞凋亡过程中，由于细胞浆和染色质浓缩、核裂解，产生凋亡小体，使细胞的光散射性质发生变化，通过流式荧光细胞仪的分析显示， 射线辐射可使前列腺组织细胞周期时相发生改变，凋亡细胞核在二倍体峰前出现亚二倍体峰“凋亡峰”，随着辐射后时间的延长，可检测到的凋亡细胞逐渐增多。前列腺细胞发生凋亡时的生物化学特征主要是细胞内发生一系列信号传递反应，有新的 RNA 和蛋白质合成，核酸内切酶被激活，染色质 DNA 被核酸内切酶降解，产生若干大小不一的多聚
14、核苷酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上呈现阶梯状图谱(DNA ladder)，利用这一特征可以对细胞凋亡进行检测。DNA 琼脂糖凝胶电泳可见对照组基因组 DNA 保持完整，经 射线辐射 7 d 后基因组 DNA 发生断裂，呈现典型的凋亡改变即 DNA ladder，表明 射线可使细胞核内 DNA 在核小体连接处发生断裂，形成 180200 bp 及其整数倍的核苷酸片段。本实验通过 TUNEL 染色、流式细胞术和琼脂糖凝胶电泳等方法证实， 射线内照射能够有效地使人增生的前列腺细胞凋亡，进而引起前列腺组织萎缩，为采用电离辐射治疗 BPH 提供了实验依据。【参考文献】1 Kyprianou N.Doxazo
15、sin and terazosin suppress prostate growth by inducing apoptosis：clinical significanceJ.J Urol，2003；169(4)：15205.2 Iacopino F，Angelucci C，Lama G，et al.Apoptosisrelated gene expression in benign prostatic hyperplasia and prostate carcinomaJ.Anticancer Res，2006；26(3A)： 184954.3 Ma QJ，Gu XQ，Cao X，et al
16、.Effect of beta radiation on TGFbeta1 and bFGF expression in hyperplastic prostatic tissuesJ.Asian J Androl，2005；7(1)：4954.4 马庆杰，谷欣权，曹 霞，等.辐射对前列腺增生组织中 bcl2 和 bax 表达的影响6J.中国老年学杂志，2003；23(5)：2812.5 Justulin LA，Delella FK，Felisbino SL.Doxazosin reduces cell proliferation and increases collagen fibers in rat prostatic lobesJ.Cell Tissue Res，2008；332(1)： 17183.6 Cardile V，Bellia
