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1、1p38MAPK 在慢性移植物抗宿主病狼疮样 小鼠肾组织的表达研究【摘要】 目的：探讨慢性移植物抗宿主病（cGVHD）狼疮样小鼠肾组织 p38MAPK的表达变化,进而分析 p38MAPK 在狼疮肾炎肾纤维化发生中的作用。方法：将 12只雌性(C57BL/6JDBA/2)F1 杂交鼠随机分为模型组及正常对照组,每组 6 只。于16 周末处死，取肾行 HE 和 Masson 染色，应用免疫组化方法检测 TGF-1、p38MAPK、P-p38MAPK 在肾脏的定位表达，RT-PCR 法研究各组肾组织TGF-1、p38MAPK mRNA 的表达,Western blot 定量检测 TGF-1、p38M
2、APK、P-p38MAPK 蛋白的表达水平，并观察两组小鼠 24h 尿蛋白排泄量。结果：与正常对照组比较,模型组小鼠 24h 尿蛋白排泄量、TGF-1、p38MAPK 和 P-p38MAPK 蛋白及 mRNA 表达均明显增加(P0.01),TGF-1 与 p38MAPK 的表达呈正相关(r=0.418,P0.05)。结论：cGVHD 狼疮样小鼠肾组织中 TGF-1、p38MAPK 和 P-p38MAPK 蛋白及 mRNA 表达明显上调,p38MAPK 信号通路可能在狼疮肾炎肾纤维化的进程中起重要作用。 【关键词】 慢性移植物抗宿主病； 狼疮肾炎； p38MAPK； 小鼠狼疮肾炎（lupus n
3、ephritis,LN）是系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus SLE）最重要的临床表现之一，其病理改变以肾小球、血管、肾小管及其间质损害为特征，最终急性或慢性进展为肾脏纤维化甚至肾功能衰竭。肾脏纤维化不仅是各型 LN 进展到终末期的共同病理表现，而且也是患者病情的重要反映指标，在其发展过程中，多种因素发挥着重要作用,其中 TGF-1 起着关键作用。有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK) 级联是细胞内重要的信2号转导系统,它参与胞外信号从表面转导到细胞内部的过程,为细胞内信息传递的共同通路。近年来
4、许多研究结果表明，其亚族 p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)作为信号转导通路的交汇点在肾脏纤维化的发生发展中起着重要作用，但在 LN 肾纤维化的发生过程中是否起作用尚未见报道。因此本研究通过构建慢性移植物抗宿主病(chronic graft versus host disease,cGVHD)狼疮样小鼠模型,探讨作为 TGF-1 下游信号介质，p38MAPK 在 LN 发展过程中的表达与活化及其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 实验动物810 周龄雌性(C57BL/6JDBA/2)F1 杂交鼠 (以下称杂交鼠)及 67 周龄DBA/2 小鼠购自中山大学医学动物中心,体重(20.1
5、71.20)g,SPF 级，饲养于本校公共卫生学院 SPF 动物房。1.2 模型的建立与分组1制作 cGVHD 狼疮样小鼠模型。按随机、对照设计原则将 12 只杂交鼠分成模型组及正常对照组,每组 6 只。取 DBA/2 小鼠脾脏、胸腺、淋巴结细胞,制成单细胞悬液(约 60%脾细胞、30%胸腺及 10%淋巴结细胞),分别于 0、3、7、10d 经尾静脉注射于模型组杂交鼠,用台盼蓝染色和细胞计数板计数,保证活细胞数大于 95%,且每次给予细胞数为 50106 个。正常对照组则于相应时间经尾静脉注射等体积生理盐水。两组小鼠首次尾静脉注射后每两周留取 1 次 24h 尿,至 16 周处死动物，立即取下
6、肾脏,一部分置于-70低温保存,另一部分置于 10%中性福尔马林溶液中固定后行组织病理学检查。31.3 24h 尿蛋白量测定用双缩脲比色法测定尿蛋白,小鼠尿液 15 稀释后按操作说明书操作。1.4 RT-PCR1.4.1 总 RNA 提取 从-70低温冰箱中取出肾组织,迅速用 Trizol(晶美生物技术有限公司)匀浆提取总 RNA。取 5l 总 RNA 进行甲醛变性凝胶电泳,紫外灯下观察 5、18、28s 条带清晰提示 RNA 完整无降解。1.4.2 逆转录 逆转录反应体系如下:在 PCR 管中加入 10逆转录缓冲液1l,MgCl2(25mmolL-1)2l,Oligo dT 1l,dNTPs
7、(10mmolL-1)2l,RNase inhibitor 0.25l,AMV 逆转录酶(TaKaRa 公司)1l,总 RNA 2.75l,30 10min 后 42逆转录50 min,99灭活逆转录酶 5 min,5 5 min,所得 cDNA 保存于-20用于 PCR 扩增。1.4.3 PCR 扩增 TGF-1、p38MAPK 及 GAPDH 内参照引物用 DNA Club 软件设计,由上海英骏生物工程公司合成,序列如下:p38MAPK 上游引物 5-tcgagaccgtttcagtccat-3,下游引物 5-ccacggaccaaatatccact-3,产物为 463bp；TGF-1上游
8、引物 5-tgcttcagctccacagagaa-3,下游引物 5-cttgcgacccacgtagtaga-3,产物为267bp；GAPDH 上游引物 5-acttgaagggtggagccaaa-3,下游引物 5-ccaggaaatgagcttgaca-3,产物为 608bp。反应体系:5PCR 缓冲液 10l,MgCl2 4l,dNTPs 1l,上下游引物各 1l,cDNA 模板 1l,TaqDNA 聚合酶(TaKaRa 公司)0.25l,补足双蒸水至 50l。Eppendorf AG 22331 PCR 扩增仪扩增,p38MAPK 条件为:94预变性 3min；94变性 30s,54
9、退火 40s,72延伸 1min,循环 36 次；72终末延伸 10min。TGF-1 改退火温度为 56，其余与 p38MAPK 相同。41.4.4 产物检测 扩增产物在含 0.5mmolL-1 溴乙锭的 1%琼脂糖凝胶中以45Vcm-1 电压降电泳 30min。于 Image Master VDS 凝胶扫描仪上成像,用Totallab V 2.01 凝胶图像分析软件进行半定量分析。所有 TGF-1、p38MAPK 扩增产物的吸光度均以 GAPDH 为基准校正,以 TGF-1/GAPDH、p38MAPK/GAPDH 表示。1.5 病理检查2m 连续切片,置多聚赖氨酸包被的载玻片上,分别作 H
10、E 和 Masson 染色，在普通光镜下观察各组小鼠肾组织病理变化。1.6 免疫组化检测SABC 法免疫组化染色(试剂盒购自晶美生物技术有限公司)：取 2m 厚石蜡切片脱蜡至水；加 3%过氧化氢溶液,室温下孵育 10 min；滴加胃蛋白酶修复抗原,37 孵育 15 min;加含 10%羊血清的封闭液在室温下封闭 30 min；滴加兔抗小鼠 P-p38MAPK 单克隆抗体(1100,Cell Signaling Technology 公司),或兔抗小鼠p38MAPK 多克隆抗体(1100,Cell Signaling Technology 公司)，或兔抗小鼠 TGF-1 多克隆抗体(1100,S
11、anta Cruz 公司)，4 孵育过夜,37 复温 30 min；滴加生物素偶联的羊抗兔 IgG 抗体,37 孵育 30 min；加 HRP 标记的链亲和素,37 孵育30 min；DAB 显色,苏木素复染,中性树脂封片。阴性对照：以 PBS 替代一抗。1.7 Western blot取-70 保存的肾皮质约 100 mg,加入预冷的蛋白裂解液 0.5 ml 充分裂解。4 3 000 rmin-1 离心 10 min 取上清。测定蛋白质含量，取 100 g 蛋白加入上样缓冲液,煮5沸 3 min 后进行 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。转 PVDF 膜,TTBS 封闭液 37 封闭 2
12、h,分别与兔抗小鼠 TGF-1 多克隆抗体、兔抗小鼠 p38MAPK 多克隆抗体和兔抗小鼠 P-p38MAPK 单克隆抗体,4 过夜,加入 12500 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 二抗,37 ,2 h，DAB 显色。每组重复 3 次。Western blot 条带信号强度应用 Kodak 1D 图像分析软件进行定量分析。目的条带的相对含量=V 目的条带/V 对照组。对照组的相对含量为 1.0，1.0 为表达阳性。1.8 统计学处理计数资料以 x-s 表示,采用 SPSS 13.0 统计软件进行方差分析、t 检验，相关性采用 Spearman 法分析，P0.05 为差异有统计学意义
13、。2 结 果2.1 24 h 尿蛋白量测定结果模型组小鼠 24 h 尿蛋白总量为（7.830.37）mg，显著高于相应正常对照组小鼠的（1.360.16）mg，P0.01。 2.2 肾组织 p38MAPK mRNA、TGF-1 mRNA 半定量结果RT-PCR 检测结果见图 1。模型组小鼠肾组织 p38MAPK、TGF-1 mRNA 表达分别与相应正常对照组比较差异有统计学意义(P0.01)，见表 1。表 1 两组小鼠肾组织 p38MAPK、TGF-1 mRNA 表达的半定量分析 1)与正常对照组比较，P0.012.3 肾组织 HE、Masson 染色结果6正常对照组小鼠肾小球、近端小管及远端
14、小管的大小、形态正常。模型组小鼠肾组织大多肾小球系膜细胞和内皮细胞增生,系膜区增宽，大量基质沉积,可见部分肾小球呈现萎缩硬化改变;肾小管呈多灶性萎缩及空泡变性,上皮细胞胞核脱落、坏死,管腔内可见大量蛋白管型，肾间质基质沉积明显。2.4 免疫组化结果2.4.1 肾组织中 TGF-1 表达变化 正常对照组小鼠仅在少数肾小管有微弱 TGF-1 表达,而模型组小鼠肾小球细胞、肾小管上皮细胞、血管内皮细胞和肾间质浸润的单核细胞胞浆均有 TGF-1 明显表达，染色细胞数明显增多，细胞染色程度加深。见图 2。2.4.2 肾组织中 p38MAPK 表达变化 正常对照组小鼠肾脏远端肾小管、近端肾小管及集合管上皮
15、细胞均有少量 p38MAPK 表达；模型组小鼠肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、肾小管间质中阳性细胞数显著增加，阳性表达颜色加深。见图 3。2.4.3 肾组织中 P-p38MAPK 表达变化 正常对照组小鼠仅肾小管间质有极少量的 P-p38MAPK 表达；模型组小鼠肾组织 P-p38MAPK 主要表达在肾小球系膜区、内皮细胞及脏层上皮细胞、近端和远端肾小管及集合管上皮细胞。见图 4。2.5 Western blot 检测结果Western blot 检测结果见图 5。模型组小鼠肾组织 TGF-1、p38MAPK 、P-p38MAPK 蛋白表达较正常对照组小鼠明显升高，差异有统计学意义(P0
16、.01)，见7表 2。表 2 两组小鼠肾组织 p38MAPK、TGF-1 和 P-p38MAPK 蛋白表达的定量分析2.6 肾组织 TGF-1、p38MAPK 和 P-p38MAPK 相关分析实验小鼠肾组织 p38MAPK 表达与 TGF-1 表达呈正相关(r=0.418,P0.05)，P-p38MAPK 表达与 TGF-1 表达呈正相关(r=0.432,P0.05)，P-p38MAPK 表达与 p38MAPK 表达呈正相关(r=0.414,P0.05) 。3 讨 论肾脏纤维化是几乎所有肾脏疾病发展到终末期肾功能衰竭的共同通路,包括 LN在内许多进展性肾脏疾病均具有 TGF-1 持续过度表达的特征。TGF-1 是公认的肾脏致纤维化因子之一,而 MAPK 通路是细胞内 TGF-1 信号通路的重要成分。其亚型 p38MAPK 是控制炎症反应最主要的 MAPK
