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1、1青岛农业大学本本 科科 生生 课课 程程 论论 文文题 目: 葡萄逆境胁迫诱导型启动子的克隆 姓 名: 刘丽雪 学 院: 生命科学学院 专 业： 生物技术 班 级： 2007 级 4 班 学 号： 20072833 指导教师： 薛仁镐 完成时间： 2010.8.15 2010 年 8 月 20 日2葡萄逆境胁迫诱导型启动子的克隆生物技术 刘丽雪指导教师 薛仁镐摘要：本文以葡萄幼苗为材料，依据基因组序列，设计引物，以基因组DNA为模板，利用PCR技术，对葡萄逆境胁迫诱导型启动子进行了扩增，获得了约1.4 kb的启动子序列，将启动子片段回收后连接到T载体，经酶切鉴定结果表明，所需启动子成功构建到
2、T-A载体。葡萄逆境胁迫诱导型启动子的克隆对下一步抗逆调控分子机制研究及作物分子育种具有重要理论和实际意义。关键词：逆境胁迫；启动子；PCR 扩增；克隆3Cloning of Adversity Stress Promoter in GrapesStudent majoring in Biotechnology Liu lixueTutor Name Xue Ren-GaoAbstract: The promoter of gene was amplified by PCR technology using genomic DNA of grapes as template in this s
3、tudy. The 1.4 kb fragment of promoter was then ligated to the T cloning vector and confirmed by digestion with endonuclease and sequencing. Cloning of adversity stress promoter has important significance on molecular regulation mechanism of adversity and genetic breeding in crop.Key words: Stress to
4、lerance；promoter；PCR amplification；Cloning41. 引言葡萄（Vitis vinifera L.）在植物学分类中属于葡萄科(Vitaceae Lindley 或 Ampelideae Kunih)葡萄属(Vitis L.)的藤本浆果。葡萄科中有 12 个属，约 600 个种1。葡萄是最古老的被子植物之一，起源于欧、亚大陆和北美洲的连片地区。主要栽培类型则起源于中亚西亚一带，主要分布于世界的温带、亚热带、热带地区，主要野生于森林、山坡或河谷等地。葡萄科中只有葡萄属有较高的经济价值，并且得到广泛的栽培和较深入的研究。葡萄是一种营养价值较高的浆果，素有水果皇后
5、的美誉，广泛应用于我们的日常生活中，它不但营养丰富、用途广泛：色美、气香，味可口，是果中佳品，既可鲜食又可加工成各种产品，如葡萄酒、葡萄汁、葡萄干等，而且果实、根、叶皆可入药，全身都是宝。是国际市场上重要的商品。启动子决定着基因时空表达的特异性，目前通常采用分子生物学手段对生物反应器进行遗传改良，希望插入的外源目的基因能够限定在某一特定的组织或部位进行高效表达，在不影响该生物反应器其它特性的前提下，能够集中在靶组织方便地收集表达产物。植物启动子由核心元件和上游元件构成,如 TATA-box 和起始因子(initiator)。在逆境相关基因的启动子序列中还存在一些与逆境诱导相关，参与基因转录调控
6、的顺式作用元件。目前研究较深入的有：脱落酸响应元件 5-8、乙烯响应元件 6-8、茉莉酸类物质应答元件8、低温响应元件12和干旱应答元件3-6等。ABA 诱导裘达基因启动子存在一个 PyACGTGGC保守序列，该序列在小麦胚胎发生晚期表达基因 E3 中首次被确定为 ABA 应答元俘，核心序列为 A/GCGT。拟南芥 RD29B 基因启动子中存在两个 ABRE，只有遮两个元件相置作用，形成 ABA 应答复合体，才能指导核心启动子的 ABA 诱导活性2。由于信号测激雨具有转录活性的启动子称为诱导型启动子。该类启动子可以快速有效地诱。在逆境相关基因的启动子序列中还存在一些与逆境诱导相关，参与基因转录
7、调控的顺式作用元件。目前研究较深入的有：脱落酸响应元件与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。旱、高盐、低温和高温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节的主要机制之一是逆境胁迫有关的转录因子非生物胁迫，如导转录基因的“开、关”：可根据需要在植物特定发育阶段、组织器宫或生长环境下接受诱导蕾号，诱导基因表达；也可以随时解除胁迫，停止表达。5非生物胁迫，如干旱、高盐、低温和高温等，可以诱导植物体内相关基因表达，其转录调节的主要机制之一是逆境胁迫有关的转录因子(调节蛋白)与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合，增强启动子的活性，提高目的基因的表达量。rd2
8、9A启动子能够驱动目的基因在干旱、低温和ABA等非生物胁迫下表达，是目前抗逆植物熬因工程中虑用最广泛的诱导型启动子。Kasuga等7分别利用35S启动子和胁迫诱导型启动子rd29A驱动拟南芥DREBIA转化拟南芥，rd29A：DREBlA转基因植株的胁迫耐性明显高于35S：DREBIA的转基因植株；而且在胁迫诱导下，rd29A驱动的目标基因表达积累与胁迫诱导相关基因的表达在相同水平中，说明诱导型启动子能更有效地提高植物对低温、干旱和高盐的耐受性。冬麦bltl01基因启动子受低温诱导，在其转录起始位点上游-168到-275区段内存在一个高度保守的TCAlike元件(TCATCTTCTr)，Bro
9、wn等首次发现该元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。 2. 材料与方法2.1 材料菌种和载体：大肠杆菌 DH5 由本实验室提供，T 载体购于 TaKaRa 公司。酶及化学试剂：各种限制性内切酶开,关、Hind、EcoR均购于 TaKaRa 公司。其他所需药品均为分析纯。开,关开,关2.2.1 引物序列的设计利用已知的基因序列找到其逆境胁迫诱导型启动子的序列并由此设计引物，设计的引物如下：VVESTPF1 ACACTCGTCCCATCTCCCATCVVESTPR1 TCCAAGTCTTTCCTAGTTGCTC2.2.2 组培培养葡萄幼苗1/2MS 生根培养基根据培养基配方，各种母液的
10、浓度及要求配制的总量计算好需要各种母液的量，分别量取50 mL 大量元素、10 mL 微量元素、10 mL 铁盐、10 mL 有机物、10 mL CaCl2等母液。加入 30g/L 蔗糖，加入 IAA，1 mg/mL，用磁力搅拌器搅拌溶解后，定容。用 1M NaOH 或 0.1M HCL 调节 pH 值到 5.8。加入琼脂，8g/L。分装，一般 1L 分为 2426 个培养瓶；封口。高压蒸汽灭菌。121下灭菌 20 min。在超净工作台上把葡萄幼苗剪切带芽幼茎接到 1/2MS 生根培养基上进行培养，完成6后放入恒温箱中保存，定期观察花生的生长情况，培养至幼茎生根发芽并发育成小苗，即可进行试验。
11、2.2.3 基因组 DNA 的 PCR 扩增以提取的葡萄基因组 DNA 为模板，利用设计的简并引物进行 PCR 扩增，获得基因片段。混合液成分 加入体积(50l)10buffer(Mg2+) 5 LdNTP(2.5mM) 8 L引物 1 (20M) 1 L引物 2 (20M) 1 LTaq(5U/l) 0.5 LDNA/cDNA 12 LddH2O 22.5 L将混合好的液体均匀的分装到两个管中，每管 25L.(2) 反应程序：各组分充分混匀后，在 PCR 仪上扩增。反应程序如下：94预变性 5min94变性 40s45-55退火 40s 72延伸 2min 完成 30 个循环72延伸 10m
12、in在 PCR 仪上扩增。扩增结束后，向反应体系中加 10L6Loading buffe，混匀，取 6L 在琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定，观察结果。2.2.4 琼脂糖凝胶电泳检测 制备凝胶：在锥形瓶中加入 0.4g 的琼脂糖和 40mL 的 TAE 缓冲液，充分溶解后，冷却后加入染料 4L。电泳板安放好梳子后倒胶，注意倒胶时要慢慢倒，不能有气泡产生。室温下放置，直至凝胶完全凝固。 在有 DNA 的离心管里加入 6Loading buffer，混匀。将电泳板放入盛有缓冲液的电泳槽内。注意点样孔端在电源的负极。然后用移液枪进行点样，每孔点样 8L。7 于电压 100V 下电泳 30-40 min。电泳
13、结束后紫外灯上观察条带。2.2.5 基因片段的回收PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，切下目的基因片段用凝胶回收试剂盒进行回收纯化。步骤为：层析柱的平衡：200L buffer GPS，2 支，室温放置 3-5min，12000rpm，离心 2min，加700L 水，12000rpm 离心 2min。放置待用。 切下目的基因片段，放入离心管中，称量，按 1g/mL 加入 Binding Buffer。55-60加热 7min，中间混匀 2-3 次。将回收的溶液加入平衡的离心柱中，10000rpm 离心 1min。弃下层溶液，加入 300L Binding Buffer，1000rpm 离心 1mi
14、n。弃下层溶液，加入 700L SPW washing buffer，10000rpm 离心 1min。重复一次。弃下层溶液， 13000rpm 离心 1min，离心柱。在管中加入 40L Elution buffer，室温放置 10min，13000rpm 离心 1min。2.2.6 PCR 扩增产物与 T 载体连接及连接产物转化一般 DNA 片段的克隆实验 配制 DNA 溶液，pmD19-T Vector 1L 加 Insert DNA4L。 加入等量的（5L）Solution。 4过夜连接 全量的（10L）加入至 100LJM109 感受态细胞中，冰中放置 30min。 42加热 90S 后，再在冰中放置 1min。 加入 750L LB 培养基，37振荡培养 60 分钟。 在超净工作台上抽取 10L，在抗 Amp 培养基上涂板，之后 37培养 12 个小时，放置待用。2.2.8 连接目的基因质粒的提取： 从制备的培养皿上挑连接目的基因的单菌落至 15mL LB 培养基中，加入 15L Amp ，37摇床培
