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1、海藻海藻 DNADNA 提取技术提取技术学院：水产与生命学院学院：水产与生命学院 班级：水产养殖班级：水产养殖 1 1 班班姓名：蔡子豪姓名：蔡子豪 学号：学号：M130101089M130101089摘要：摘要：海藻含有的多糖、多酚、蛋白、核酸酶等物质容易与其 DNA 结合形成不溶于水的复合物或造成 DNA 降解，干扰了后续的酶反应，制约了海藻 DNA 的提取。而目前海藻的分子生物学研究还比较落后，其主要的制约因素是海藻核酸的提取，而这同时也是一个世界难题。可以说多糖的去除是海藻核酸分离纯化中最普遍而又最不容易解决的难题。而现今CTAB 去除多糖效果非常显著,结合 LiCl、PVPP、苯酚抽
2、提、蛋白酶 K 处理条斑紫菜能获得大于 50kb 的高纯度 DNA,至少可保持 1 个月以上而无降解,可以直接用于测序、酶切、RFLP、基因组文库构建等工作。而试剂盒法得到的 DNA 纯度最高，但得率较低却成本较高。而 LiCl 与 CTAB 法也均能得到高质量的 DNA，但是 LiCl 法相对于 CTAB 法更加简便有效。并且，抽提前的材料预处理对 DNA 质量有明显影响。关键字关键字：海藻；DNA 提取；多糖大部分的养殖海藻，如紫菜、海带等不但经济价值高、营养价值好，而且还有抗氧化、降血脂等重要作用1-3 ,现今在中国已成为水产养殖业的一个不可或缺的支柱产品。然而，伴随着如今养殖规模的不断
3、扩大,近年来出现了养殖品种退化和病害问题的严重局面。因此,从基因、基因组水平研究海藻的生长发育规律以及优良性状形成的分子基础,是培育高产、优质、抗逆新品种的最佳途径,而且还可改善甚至解决我国现今海藻养殖的许多问题。并且由于海藻栖息环境的特殊性，故具有许多不同于陆生生物的特性，这些特性为海洋药物开发利用提供了宝贵资源 4，而海洋药物开发利用的一个重要部分是海洋基因资源的筛选、克隆、重组和表达。进行上述有关海藻研究的第一步，也是关键的一步是高质量核酸分离纯化。因为核酸质量对后续的反转录、限制性内切酶酶切、Northern 杂交、基因文库构建等均有显著影响。所以高质量核酸是后续试验成功的基础与保障。
4、由此可以看出，海藻的 DNA 提取对于海藻的研究是一个不可或缺的重要技术。然而目前海藻的分子生物学研究还比较落后,其主要制约因素是海藻核酸的提取,也是一个世界性的难题。海藻富含多糖、多酚、蛋白、核酸酶、次级代谢产物等物质，容易与核酸结合形成不溶于水的复合物或造成核酸的降解，因此海藻核酸抽提一直是一个难题。为了获得高质量海藻核酸，不少学者在海藻核酸抽提技术上进行了改进。在某个物种中成功应用的方法经常在应用于其它物种时失败,一种特殊的 DNA 提取方法通常只在一个或几个物种中适用(Olsen1990)5;而且一种方法往往不足以处理与 DNA 提取相关联的所有问题,只能针对不同的物种采取不同的处理策
5、略。海藻 DNA 提取的主要问题是次生代谢产物如丹宁、多酚的存在,尤其是多糖的影响。红褐藻中主要的碳水化合物是硫多糖和梭酸多糖,而且比陆生植物的中性多糖更易溶解,使溶液高度粘稠,难以提取和纯化 6。为了减少多糖的影响,Mayes等 7,采用减数分裂后含有微量多糖的海带抱子作为 DNA 提取的材料,所得纯化DNA 适用于限制性酶切反应、Southern 杂交和 PCR 反应。这种方法虽然尽量避免了多糖的影响,但抱子不易获得,在数量和时间上对 DNA 提取有很大限制。通常,粘稠易溶的多糖在用液氮研磨紫菜(porphyra)组织的过程中释放,Annett 等 8。以紫菜原生质体为材料配合使用蛋自酶
6、K 和酚抽提提取 DNA,获得了较好的效果。 Hong 等,利用 Licl 软化海藻组织.替代液氮研磨也从紫菜中提取得较高质量的 DNA 并成功用于 PCR 反应,为 DNA 提取技术提供了新思路6。为了减少对大量新鲜藻体的依赖和可以使用己保存多年的标本,一些学者尝试选用干藻体提取 DNA。 Goff 和 Moon 从保存在标本室达 11 年之久的干燥的江篱囊果中提取DNA,扩增了质体 Rtbisco 和核核抽体基因并测序,其扩增片段大小及序列与从新鲜藻材中获得的结果相似。Saunders 提出一种快速简单的胶纯化的方法,从多种红藻干燥藻体中成功分离微量基因组，用于 PCR 及进一步的分子分析
7、。而早期,Cscl 梯度离心是海藻 DNA 粗提物的主要纯化手段9-11。近来,DNA 纯化试剂盒开始成功应用于海藻 DNA 纯化 12。下面对目前有关提取海藻 DNA 的几个主要方法和相关内容进行简要介绍。1 1、方法介绍、方法介绍1.11.1 试剂盒法试剂盒法DNA 提取试剂盒是根据氯化芐法构建的，能够从样本中提取基因组 DNA 的试剂盒。氯化苄具有能将含有纤维素等的细胞壁中的羟基苄基化，从而破坏细胞壁的特性。本制品利用了氯化苄的这一特性，将植物样品冻结融解后，再使用 Pipet Tip 的尖端将植物样品在 Microtube 壁上数次按压即可破坏细胞壁。本法与传统方法相比，省去了液氮研磨
8、等烦琐步骤，有利于一次性处理大量样品。而且，本制品经过了改良，热处理时间只需 15 分钟，使用本制品从实验开始至水相回收只需 30 分钟时间。得到的基因组 DNA 可以进行 PCR 扩增及限制酶处理等。DNA 提取试剂盒主要可以分为以下几大类：小量全血基因组 DNA 提取试剂盒、中量全血基因组 DNA 提取试剂盒、组织/细胞基因组 DNA 提取试剂盒、中量/大量组织/细胞基因组 DNA 提取试剂盒、全血/组织/细胞基因组 DNA 提取试剂盒、CTAB 植物基因 DNA 提取试剂盒、新型植物基因组 DNA 提取试剂盒、酵母基因组 DNA 提取试剂盒、M13 噬菌体单链基因组 DNA 提取试剂盒。
9、1.21.2 CTABCTAB 法法1.2.11.2.1 传统的传统的 CTABCTAB 法法CTAB 是一种阳离子型表面活性剂,当溶液中 NaCl 浓度大于 0.5 mol/L 时,它可以选择性地同细胞碎片、变性的蛋白质和多糖结合形成不溶性复合物,而核酸仍处于溶解状态,通过等体积的氯仿/异戊醇(24:1,体积分数)抽提可除去多糖。值得注意的是,当 NaCl 浓度小于 0.5 mol/ L 时, DNA 将在室温下与 CTAB 形成沉淀13。该方法去除多糖的效果非常明显,以往多用于植物基因组 DNA 的提取14-15,近来逐渐用于微生物16、海洋生物核酸的提取中。1996 年 Kitade 在
10、提取条斑紫菜基因组 DNA 时,先经 CsCl 密度梯度离心除去蛋白质后,再用 CTAB 处理,获得的 DNA 分子量在 25-166 kb 之间,产率平均为 17.7Lg/g 组织。Phillips16-17 利用改进的 CTAB 法从马尾藻中提取到高分子量的 DNA 样品,可用于基因库的构建。De Cler-ck13 结合使用 CTAB 和 Sephaglass Bandprep Kit,从褐藻门 Dictyota 属的 7 个种中提取到高质量的 DNA 用于 PCR 扩增及RFLP 分析。因 CTAB 处理多糖大多在 65e 进行,所以 CTAB 溶液中一般加有体积分数为 1%的 B-巯
11、基乙醇以增加溶液的还原性,防止核酸酶的降解17 。1.2.21.2.2 改进的改进的 CTABCTAB 法法改进的 CTAB 参考常规方法,并根据李晋楠等的方法进行修改18: 200 mg材料,液氮研磨后加入 1 mL 预热 CTAB 提取液(100mmol/LTris-Hc,l 100mmol/LEDTA, 1. 4mol/LNaC,l 2%CTAB),使用前加入 2%B-巯基乙醇, 65e 水浴 1 h,其间每隔 5 min 振荡混匀。加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇(25: 24: 1)混合振荡 20 min,10 000 rpm 离心 10 min,取上清,加入 0. 35 倍体积的无水
12、乙醇和 0. 2 体积的 5 mol/L 的 KAc 混匀,离心后取上清加入半体积异丙醇, -20e 冷冻 30 min, 10 000 rpm 离心 10 min,吹干后加入 400LLmol/LNaCl 和 1. 5LLRNase, 37e 水浴 30 min 消解 RNA。将 5 个离心管中的溶液收集合并,加入预冷的无水乙醇沉淀, -20e 静置超过 10 min 后离心,沉淀用 70%酒精洗涤,晾干后溶于 200LLTE 中。1.31.3 .LiC.LiC l l 法法1.3.11.3.1 LiClLiCl 软化组织法软化组织法起初人们利用 LiCl 软化海藻组织,使染色体易于观察;后
13、来又发现 50 mmol/L 的浓度就可以打破哺乳动物细胞膜, Raha 1990 年使用 LiCl 和苯酚抽提从哺乳动物细胞中提取到了细胞总 RNA 和 DNA。1992 年 Hong 通过实验发现,紫菜在含有 0.51.0 mol/LLiCl 的提取液中 55e 处理 5 min,再 4e 振荡 1 h,低速离心除去残渣,存在于上清中的 DNA 用乙醇沉淀后即可用于酶切或 PCR。对该方法进行改进后,Hong19从 18 个属 26 个种的海藻中提取到可以进行 RAPD 分析的高质量 DNA;提取液中加入 4 mol/L 异硫氰酸胍可以用来提取足以进行差异显示的总 RNA。Ji 等利用 L
14、iCl 法从 Hizikia fusiformis 中提取到高质量的 DNA,用于 RAPD 分析,研究了从不同海域采集的藻株的遗传多变性。这种方法步骤少,操作简便,不需要液氮研磨、苯酚/氯仿抽提、CsCl 密度梯度离心,费用低廉,对人体没有毒害。1.3.21.3.2 LiClLiCl 沉淀法沉淀法在高浓度的 LiCl(3-4 mol/L)存在下, RNA 难以溶于水,可以通过离心沉淀下来,而大部分多糖仍留在上清中,少数与 RNA 共沉淀的多糖可以在高浓度的 K+或 Na+存在下通过苯酚/氯仿抽提除去。Su 和 Gibor 曾将 LiCl 沉淀与其它方法结合使用,从大型海藻中提取到高质量的 R
15、NA,可用于 RT-PCR 和 cDNA 文库的构建。但该方法单独使用去除多糖的效果并不佳20,而且 LiCl 沉淀一般需要在-20e 过夜,大大延缓了实验的进程,而对于多糖含量较高的海藻及植物,需要与其它方法结合使用才能得到满意的效果。2.2.小结小结以上为国内现今在海藻 DNA 提取方面主要的几种方法，除此以外仍有许多对其不同问题而解决的提取方法，在此不做一一介绍。目前国内一些传统生物技术已广泛应用于藻类研究,但在应用分子生物学技术来有目的地深入研究海藻则是近些年才开展21。基因组 DNA 的提取技术是分子生物学研究中的基本技术,DNA 样品的质量对于实验的成败至关重要。可以说多糖的去除是
16、海藻核酸分离纯化中最普遍而又最不容易克服的难题,而以上中 CTAB 去除多糖效果非常显著,结合 LiCl、PVPP、苯酚抽提、蛋白酶 K处理条斑紫菜能获得大于 50kb 的高纯度 DNA,至少可保持 1 个月以上而无降解,可以直接用于测序、酶切、RFLP、基因组文库构建等工作22。在实际工作中应针对样品的特性选择适当的实验方案,尽量简化操作步骤。而传统的 CTAB 法虽然在植物中发展的较为成熟,但在海藻 DNA 提取的过程中但还有很多问题存在,罗立明等23指出,藻类富含蛋白多糖等物质,这些杂质降低了 DNA 的质量,导致实验需要反复多次抽提,降低了提取效率。裂解与破碎细胞壁,使 DNA 透出是抽提中必需解决的问题24。在已报道的藻类提取方法中,很多都采用海螺酶、蛋白酶 K 等进行消化,以解决液氮破碎细胞后裂解物黏稠、DNA 得率低且有严重的多糖污染等难题25,但这无疑
