《生物技术制药复习提纲2010》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物技术制药复习提纲2010（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、2010 生物技术制药复习提纲生物技术制药复习提纲一、一、基本概念基本概念1 质粒质粒:细菌细胞内一种自我复制的环状双链 DNA 分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。2 生物药物生物药物:生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。生物药物，包括生物技术药物和原生物制药。3 贴壁细胞贴壁细胞:这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长，繁殖。4 单克隆抗
2、体单克隆抗体:只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个淋巴细胞的克隆或一个杂交瘤细胞的克隆。 5 多克隆抗体多克隆抗体:由单一杂交瘤细胞克隆分泌的只能识别一种表位（抗原决定簇）的高纯度抗体。6 人人-鼠嵌合抗体鼠嵌合抗体:将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区融合而制成的抗体。其具有鼠源抗体结合抗原的特异性和亲和力，同时降低了鼠源抗体对人体的免疫原性。 7 改形抗体改形抗体/Fab Fv 抗体抗体/单链抗体单链抗体8 植物的分化植物的分化9. 脱分化脱分化:是指分化细胞失去特有的结构和功能变为具有未分化细胞特性的过程。10.再分化再分化:某种组织细胞去分化后变为原始未分化状态，随后分化为另一
3、种组织细胞的过程。多存在于再生过程中。 10.愈伤组织愈伤组织:原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。11.继代培养继代培养:继代培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养。12. 固定化酶固定化酶:水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。在催化反应中以固相状态作用于底物。 13.固定化细胞固定化细胞14.模拟酶模拟酶:用合成高分子来模拟酶的结构、特性、作用原理以
4、及酶在生物体内的化学反应过程，所制造的具有酶性质的催化剂。二、二、技术原理技术原理1 简要说明影响目的基因高效表达的因素简要说明影响目的基因高效表达的因素（1）外源基因的剂量 细菌内基因拷贝数增加，基因的表达产物也增加。（2）外源基因的表达率 启动子的强弱 核糖体结合位点的有效性 SD 序列和起始密码的间距 密码子的组成（3）表达产物的稳定性 即使外源基因原始表达量很高，由于很快在菌体内被降解，导致实际产量很低。（4）细胞代谢负荷 大量的外源基因表达产物可能打破宿主细胞的生长平衡，从而影响到其他代谢过程。2 基因载体应具备的条件基因载体应具备的条件载体 DNA 是单个复制单元，在宿主细胞内应具
5、有 DNA 独立复制能力； 分子尽量可能的小，以便容易从细胞中分离纯化，便于离体条件下操作 含有多种限制性内切酶的单一切点。在切点内可以与外源 DNA 进行连接、重组； 载体内有不影响其复制、生长的非必要区域，在此区域内可以插入、接受外源 DNA，外 源 DNA 与载体分子一起复制、扩增； 具有多种选择性标志，如营养缺陷型、抗药性、形成噬菌斑的能力、外源性蛋白质的产 生等，作为区分重组的转化子与非重组转化子的指标。3 导致基因工程菌中质粒不稳定的原因及如何提高质粒的稳定性导致基因工程菌中质粒不稳定的原因及如何提高质粒的稳定性质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂是
6、出现一定比例不含质粒的子代菌现象，与两个因素有关：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是含质粒菌和丢失质粒菌在生长速率上的差异。质粒的结构不稳定是目的 DNA从质粒上丢失或碱基重排、缺失导致工程菌性能的改变。提高质粒稳定性的方法：选择合适的宿主菌；选择合适的载体；在培养基中加选择性压力，抑制质粒丢失菌的生长；分阶段培养，第一阶段进行生长，维持菌体的稳定性，第二阶段进行表达；控制培养条件 ；细胞固定化4 简述三种分离纯化常用色谱方法的基本原理简述三种分离纯化常用色谱方法的基本原理离子交换层析，基本原理：通过带电的溶质分子和离子交换剂中的可交换离子进行交换，从而达到分离的目的。疏水层析，基本原
7、理：主要是利用蛋白质分子表面上的疏水区域和介质中的疏水基团之间的相互作用，无机盐的存在能使相互作用增强，因此在疏水层析过程中采用高盐浓度上样，低盐浓度洗脱，从而对蛋白质组分进行分离。亲和层析，基本原理：利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附后，再利用洗脱液进行洗脱，解除结合，从而达到分离目的。5 试比较动物细胞和植物细胞生理特点的异同试比较动物细胞和植物细胞生理特点的异同相同点相同点不同点不同点动物细胞动物细胞植物细胞植物细胞1、 结团生长细胞分裂后没有进行细胞分离植物细胞易分泌黏多糖和蛋白质，易造成细胞结团2、抗外作用能力纤维素细胞壁使其外骨架脆弱抗张力强度大，抗剪切能力小3
8、、易造成细胞培养液黏度增加4、好氧控制供氧量，保护较低的溶氧水平5、二氧化碳、泡沫控制限制通气速率，通入一定的二氧化碳机械和化学方法控制泡沫6、避免培养液黏附于反应器表面 细胞的分裂周期长细胞分裂时间为 1248h，细胞的分裂周期=间期+分裂期间期（G1+S+G2）分裂期（M） 细胞生长需贴附于基质,并有接触抑制现象 正常二倍体细胞的生长寿命是有限的原代培养有限细胞系无限细胞系动物细胞对周围环境十分敏感对理化因素敏感，如：渗透压、pH、离子浓度、剪切力、微量元素等。 动物细胞对培养基要求高必需氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、葡萄糖、细胞生长因子、贴壁因子等。 动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功
9、能与细 菌不同动物细胞蛋白质的合成部位：游离核糖体粗面内质网的核糖体游离核糖体：细胞质基质内，合成蛋白质。粗面内质网的核糖体：是分泌的和膜中的整合蛋 白，多为糖蛋白，合成蛋白质。6 试比较说明动物细胞培养基与植物细胞培养基的区别试比较说明动物细胞培养基与植物细胞培养基的区别7 试比较动物细胞与植物细胞培养操作方式的异同点试比较动物细胞与植物细胞培养操作方式的异同点8 抗体的基本结构及每一区域的功能作用抗体的基本结构及每一区域的功能作用（所有抗体均是 Ig,但并非所有 Ig 分子都具有抗体活性）Ig（免疫球蛋白）分子的基本结构是由四肽链组成的。即：由二条相同的分子量较小的肽链(轻链)和二条相同的
10、分子量较大的肽链(重链)组成。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为 Ig 分子的单体；单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构；所有抗体的单体都是四条肽链的对称结构，即：两条糖基化重链(H)和两条非糖基化轻链(L)；每条重链和轻链分为氨基端(N 端)和羧基端(C 端)。L 链 N 端1/2处（VL）108-111个氨基酸残基，H 链 N 端1/5-1/4处（VH）118个氨基酸残基， V 区有一个肽环65-75个氨基酸残基。通过对 H 链或 L 链的氨基酸序列比较分析，发现：其 N-末端序列变化很大，称此区为可变区（V 区） ；可变区可又分为高变区（HVR） 和骨架区（FR） ，高变区
11、为抗体与抗原的结合位置，称为决定簇互补区（CDR） ，VL 和 VH 的 HVR1，HVR2，HVR3又分别称为 CDR1，CDR2，CDR3，其中 CDR3具有更高的高 变程度，H 链在与抗原结合中起重要的作用。 C-末端氨基酸则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区（C 区） ；在同一种属动物中是 比较恒定的，是制备第二抗体进行标记的重要基础。 链内二硫键折叠成球形区称为功能区其氨基酸的顺序具有高度的同源性。功能区的作用功能区的作用： （1）VL 和 VH 是抗原结合的部位。 （2）CL 和 CH1上具有同种异型的遗传标记。 （3）IgG 的 CH2和 IgM 的 CH3具有补体 C1q 结合
12、位点；IgG 借助 CH2部分可通过胎盘（4）CH3或 CH4具有结合单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B 细胞、NK 细胞 Fc 段受体的功能，不同的 抗体可与不同的细胞结合，产生不同的免疫效应。9 简要说明制备的单链抗体的基本原理及该抗体的优点。简要说明制备的单链抗体的基本原理及该抗体的优点。B 细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的 B 淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。 单链抗体的优点： 可去除非特异
13、性反应的竞争性表面蛋白，肿瘤显象背景更加清晰性 易渗透肿瘤组织中增加药物治疗浓度 免疫源性小，可消除人抗鼠的排异反应10 试以环糊精为例说明模拟酶制备的基本原理试以环糊精为例说明模拟酶制备的基本原理三、三、技术方法技术方法1 基因工程药物制造流程基因工程药物制造流程目的基因的获得 组建重组质粒 构建基因工程菌 培养工程菌 产品分离纯化 除菌过滤 半成品检验 成品检验2 试述获得目的基因的一种方法试述获得目的基因的一种方法反转录法 反转录聚合酶链反应法 化学合成法 对已发现基因的改造 筛选基因的新方法反转录聚合酶链反应法是将 mRNA 经反转录合成 cDNA 第一链，不需合成 cDNA 第二链，
14、而是在特异引物的协助下，有 PCR 法进行扩增，特异地合成 cDNA 链，用于重组、克隆。3 如何将目的基因与载体进行连接如何将目的基因与载体进行连接(几中末端的连接策略几中末端的连接策略)4 单克隆抗体制备的流程，并简要说明每一步骤的理论依据。单克隆抗体制备的流程，并简要说明每一步骤的理论依据。5 简要说明酶的固定化方法简要说明酶的固定化方法6 固定化酶反应器的类型特点及选择依据固定化酶反应器的类型特点及选择依据一、反应器的类型和特点 间歇式搅拌罐反应器：用于游离酶反应后随即放料。 连续流动搅拌罐反应器：连续进料、连续出料 填充床反应器：固定化酶填充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流
15、形。底物以恒定流速通过反应床。 流化床反应器：底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的 循环反应器部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。 连续流动搅拌罐-超滤膜反应器由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成的反应器。它在连续流动搅拌罐的出口处装有半透膜二、反应器的选择依据 根据固定化酶的形状来选择 根据底物的物理性质来选择 根据反应的动力学特性来选择 根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择 根据操作要求及反应器费用来选择四、四、实践与进展实践与进展 1 已知拟南芥中某一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，请选已知拟南芥
16、中某一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，请选择一种单细胞微生物，设计一个实验流程确保能得到最终产物？择一种单细胞微生物，设计一个实验流程确保能得到最终产物？2 最近发现一种新型病毒，你如果开发一种该病毒的诊断试剂？最近发现一种新型病毒，你如果开发一种该病毒的诊断试剂？3 某质粒载体具有某质粒载体具有 TetTetr r和和 KanKanr r表型，在表型，在 KanKan 抗性基因内有一抗性基因内有一BglBgl的切点。现用的切点。现用BglBgl切割该载体进行外源基因克隆，问：切割该载体进行外源基因克隆，问：（1 1）重组质粒转化后涂皿时应加什么样的抗生素？）重组质粒转化后涂皿时应加什么样的抗生素？（2 2）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？）培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型？（3 3）如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体？）如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组
