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1、第一部分第一部分 基础生化实验基础生化实验实验一实验一 氨基酸及蛋白质的性质氨基酸及蛋白质的性质【实验目的实验目的】1. 加深理解所学有关的蛋白质性质的理论知识2. 掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量分析的方法及原理一、蛋白质呈色反应一、蛋白质呈色反应蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生 了生成有色的物质的反应。不同蛋白质分子所含的氨基酸残基也是不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全一样。另外 呈色反应并不是蛋白质的专一反应，某些非蛋白质类物质（含有-CS-NH、-CH2-NH2、-CRH-NH2、-CHOH- CH2NH2等基团的物质）也能发
2、生类似的颜色反应。因此，不能仅仅根据呈色反应的结果为阳性就来判断 被测物质一定是蛋白质。注意：本次实验为定性实验，试剂的量取用滴管完成。（一）双缩脲反应（一）双缩脲反应【实验原理实验原理】当尿素经加热至180左右时，两分子尿素脱去一分子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条 件下双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。其反应过程如下：COH2NH2N+COH2NH2N1800CH2NCNHCNH2OO+NH3多肽及蛋白质分子结构中均含有许多肽键，其结构与双缩脲分子中的亚酰胺键相同。因此，在碱 性条件下与铜离子也能呈现出类似于双缩脲的呈色反应。其反应过程如下：【试剂试剂】1. 蛋
3、白质溶液（鸡蛋清用蒸馏水稀释10倍，通过2-3层沙布滤去不容物）2. 0.1%甘氨酸溶液3. 0.01%精氨酸溶液 4. 10%NaOH溶液5. 1%CuSO4溶液6. 尿素结晶【实验操作实验操作】1.1. 双缩脲的制备双缩脲的制备取少许尿素结晶 (约火柴头大小)放入干燥的试管中，微火加热至尿素熔解至硬化，刚硬化时立即 停止加热，此时双缩脲即已形成。冷却后加10%氢氧化钠溶液约1ml、并震荡，再加入1%硫酸铜溶液2滴， 再震荡，观察颜色的变化。注意：a.在操作过程中试管不能冲向其他人以防止烫伤；b.控制加热的时间既不能过长也不能过短；c.加热时火不能太大，防止碳化。2.2. 观察现象观察现象
4、另外取试管4支，按照下表加入各种试剂，观察并解释现象。表1.管号试剂 1234 蛋白质样液（ml）1.0 0.01%精氨酸（ml）1.0 0.1%甘氨酸（ml）1.0 10%NaOH（ml）2.02.02.02.0 蒸馏水（ml）1.0现象 （二）茚三酮反应（二）茚三酮反应【实验原理实验原理】在弱酸条件下（pH5-7） ，蛋白质或氨基酸与茚三酮共热，可生成蓝紫色缩合物。此反应为一切蛋 白质和氨基酸所共有(亚氨基酸如脯氨酸和羟脯氨酸产生黄色化合物)。含有氨基的其他化合物亦 可发生此反应。第一步：COCOCOHOH+CCOOHHNH2RCOCOCHOH+RCHONH3CO2+第二步：COCOCHO
5、H+COCOCCOCOCO+2NH3NH2COCOCN+2H2O【试剂试剂】1. 蛋白质样液：（与双缩脲反应相同）2. 0.1甘氨酸溶液：（与双缩脲反应相同）3. 0.2茚三酮溶液【实验方法实验方法】取试管 2 支，分别加入蛋白质样液及 01甘氨酸溶液 1ml，然后各加入茚三酮溶液 0.5ml，混匀 后于沸水浴中加热数分钟，观察现象，记录结果并解释原因。（三）蛋白黄反应（三）蛋白黄反应【实验原理实验原理】在蛋白质分子中，具有芳香环的氨基酸(如酪氨酸，色氨酸等)残基上的苯环经硝酸作用可生成黄 色的硝基化合物，在碱性条件下生成物可转变为桔黄色的硝醌衍生物，反应为：OH+HNO3HONO2+H2OH
6、ONO2+NaOHONOHOH多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以都会发生黄色反应。苯丙氨酸不易硝化，需加少量浓 硫酸后才能够发生黄色反应。【试剂试剂】1. 蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）2. 浓硝酸3. 20NaOH 溶液4. 0.1%石炭酸溶液【实验操作实验操作】1. 取 1%石炭酸溶液约 1ml 放在试管内，加浓硝酸 5 滴,用微火小心加热，观察结果。2. 取干燥洁净试管 1 支，加蛋白质样液 1ml 和浓硝酸 5 滴，出现沉淀，加热，不必至沸腾，则沉 淀变成黄色，待试管冷却后，向两管各加 20NaOH 溶液使成碱性，观察颜色变化，记录结果并解释现象。（四）坂口反应（四）坂口反应【实验
7、原理实验原理】蛋白质在碱性溶液中与次氯酸盐（或次溴酸盐）和 -萘酚作用产生红色的产物。这是由于蛋白质 分子中精氨酸胍基的特征反应。许多胍的衍生物如胍乙酸、胍基丁胺等也发生此反应。精氨酸是唯一 呈正反应的氨基酸，反应灵敏度达 1：250000。反应方程式为COOHCHNH2CH2CH2CH2NHCNH2NHHOCOOHCHNH2CH2CH2CH2NHCNH2ONH3+生成的氨可被次溴酸钠氧化生成氮。在次溴酸钠缓慢作用下，有色物质继续氧化，引起颜色消失， 因此过量的次溴酸钠对反应不利。加入浓尿素，破坏过量的次溴酸钠，能增加颜色的稳定性。此反应 可以用来定性鉴定含有精氨酸的蛋白质和定量测定精氨酸的含
8、量。【试剂试剂】1 蛋白质溶液：与双缩尿反应相同2 次溴酸钠溶液3 10%NaOH 溶液4 0.2%-萘酚溶液5 0.01%精氨酸溶液【实验操作实验操作】1 于试管中加入蛋白质溶液 1ml，再加 10%NaOH 溶液 0.5ml，0.2%-萘酚 2 滴，混合后再加次 溴酸钠溶液 2 滴，观察现象2 取 0.01%精氨酸溶液 1ml，按上述操作观察现象蛋白质沉淀反应蛋白质沉淀反应蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析 出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。（一）蛋白质的盐析作用（一）蛋白质的盐析作用【实验原理实验原理】盐析现象是指般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解
9、度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时， 蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐析作用与两种因素有关：蛋白质分子被浓盐脱水；分子所带电荷 被中和。蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水 稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子 量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液 中才能析出。【试剂试剂】1. 鸡蛋清的氯化钠溶液（一份鸡蛋清加 10 份的 0.9%氯化钠溶液）2. 固体硫酸铵3. 10氢氧化钠溶液4. 1%硫酸铜溶液【实验操作实验操作
10、】1 取鸡蛋清氯化钠溶液约 2ml 于试管中，加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时溶 液颜色为乳白色，用滤纸过滤。2 取滤液做双缩脲反应，检查滤液中有无蛋白质存在。 3 蛋白质沉淀用 1ml 蒸馏水溶解后作双缩脲反应，证明盐析的蛋白质重新溶解于水而未引起变 性。（二）重金属盐类沉淀蛋白质（二）重金属盐类沉淀蛋白质【实验原理实验原理】溶液 pH 在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如 Pb2+、Cu2+、Hg2+及 Ag+等)易与蛋白质结合成不溶 性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用 某些重金属盐(如硫酸铜或醋酸铅)沉淀蛋白质时
11、，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。【试剂试剂】1. 蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）2. 5CuS04溶液3. 3AgNO3溶液【实验操作实验操作】1 取试管 2 支各加蛋白质溶液 1ml2 向各管分别滴加 2-3 滴加 5CuS04 溶液、3AgNO3 溶液，观察各管所生成的沉淀。3 在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入 5CuS04 溶液， 观察沉淀的溶解。（三）有机酸沉淀蛋白质（三）有机酸沉淀蛋白质【实验原理实验原理】生物碱是植物中具有显著生理作用的类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作 用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨
12、酸等。当蛋白质溶液 pH 值低于其等 电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸 沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质。【试剂试剂】1. 蛋白质溶液（与双缩脲反应相同）2. 10三氯醋酸溶液3. 20水杨磺酸溶液【实验操作实验操作】1. 取蛋白质溶液 1ml 于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象；2. 取蛋白质溶液 1ml 于试管中，加数滴水杨磺酸溶液，观察现象。（四）加热沉淀蛋白质（四）加热沉淀蛋白质【实验原理实验原理】大多数蛋白质在加热时，由于空间结构被破坏而丧失其稳定性，因此变性凝固。蛋白质的热变性 作用与
13、加热时间平行，并随温度的升高而加快。短时间加热可引起凝固。加热时，盐类的存在及溶液 酸碱度对蛋白质的凝固有很大影响。处于等电点状态的蛋白质加热时凝固最完全、最迅速。在强酸强 碱溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负虽加热也不凝固。但溶液中若有中性盐存在，则蛋白质可因加 热而凝固。【试剂试剂】1. 蛋白质溶液(与双缩脲反应相同)2. 1醋酸溶液3. 10醋酸溶液4. 10氢氧化钠溶液5. 饱和氯化钠溶液【实验操作实验操作】取试管 4 支依下表所示添加试剂。表2.管号试剂 1234 蛋白质样液(ml)1.01.01.01.0 1% 醋酸，滴1 10% 醋酸，滴10 10% NaOH，滴10 蒸馏水，滴1
14、01111现象加毕混匀，观察各管的情况。然后放入沸水浴中加热 10 分，注意观察比较各管的沉淀情况。其中 2 号管溶液接近于蛋白质等电点，最不稳定，最先沉淀；其次是第一管；3 号和 4 号管因在较强的酸或 碱下，蛋白质带有大量的电荷，虽然加热也不沉淀。向第三管中加入少许饱和氯化钠溶液，立即出现 白色沉淀。Experiment 1 The Properties of Protein and Amino Acid【Purposes】1 Validate the principle about properties of protein and amino acid which we have le
15、arned.2 Master the methods and principles of quantitating and determining the natures of protein and amino acid.Color Reactions of ProteinColor reactions of protein mean that some chemical bonds of protein or chemical groups of amino acid residues can react with specific reagents to form specific co
16、lored substances. The amino acid residues of different proteins are not quite the same. Therefore, colors of the products are not exactly the same. Color reactions are not the specific reactions of protein and some nonprotein substances (e.g.-CS-NH、-CH2-NH2、-CRH-NH2、-CHOH-CH2NH2) can also have similar color reactions. Consequently we cannot judge protein from the results of the
