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1、【本讲教育信息本讲教育信息】一、教学内容一、教学内容 选修 1 生物化学与分子生物学技术实践【重点导学】 蛋白质的分离与纯化 从生物材料中提取某些特定成分 分子生物学进展与 PCR 技 术【全面突破全面突破】 知识点知识点 1 蛋白质的分离与纯化蛋白质的分离与纯化 1、蛋白质的分离2、蛋白质的纯化方法 透析法 蛋白质分子不能通过半透膜（肠衣、玻璃纸、动物膀胱膜等）的特性，可将待纯化的 蛋白质溶液装入半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（缓冲液）中进行透析。离心沉淀法 控制离心速率，使得分子大小、密度不同的蛋白质发生沉降分层，从而达到分离出不 同蛋白质的目的。凝胶色谱法 又叫分配色谱法。是
2、根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实 际上是一些微小的多孔球体。这些小球体大多数是由多糖类化合物（葡聚糖或琼脂等）构 成的。电泳法：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象称为电泳。支 持物电泳是目前纯化蛋白质的一种较为普遍的方法。支持物可以是滤纸、可以是醋酸纤维 薄膜、大分子凝胶等。采用醋酸纤维薄膜作为支持物具有方法简单、快速、分离清晰、灵 敏度高、样品用量少、没有吸附、点样后区带界限清晰等优点，广泛应用于科学实验、临 床化验和生化产品的分析（血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白等的分离与鉴定）等方面。 醋酸纤维薄膜点样的操作流程：几点说明： 1）膜的预处理：必须于电泳
3、前将膜片浸泡于缓冲液中，浸透后，取出膜片并用滤纸吸 去多余的缓冲液，不可吸得过干。 2）加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法等因素决定。对血清 蛋白质的常规电泳分析，每厘米加样线不超过 23L，相当于 6080 g 的蛋白质。 3）电泳：可在室温下进行。电压为 25 Vcm，电流为 0. 40. 8 mAcm 。 4）染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，血浆蛋白用甲苯胺蓝或过碘酸- Schiff 试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。 5）脱色与透明：对水溶性染料应用最普遍的脱色剂是 5醋酸水溶液。为了长期保存 或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水乙醇=3：7 的
4、透明液中。【典型例题典型例题】例 1、回答有关蛋白质分离和纯化的问题 （1）要获得血清蛋白的粗制品，必须将含有柠檬酸钠的血液进行 处理，然后 将 装入透析袋中除去 。 （2）要获得血红蛋白，应如何破碎红细胞？ 。 （3）下图为血清蛋白通过醋酸纤维薄膜的电泳图谱，你认为含量最多的蛋白质是 ， 含负电荷最多的球蛋白是 ，相对分子质量最大的球蛋白是 。（4）电泳是目前应用最为普遍的 蛋白质的方法。 解析：解析：本题考查蛋白质分离和纯化的基础知识。 答案：答案：（1）离心 上清液 小分子物质 （2）加蒸馏水使其胀破 （3）清蛋白 -球蛋白 -球蛋白 （4）（分离）纯化知识点知识点 2 从植物材料中提取
5、某些特定成分从植物材料中提取某些特定成分 芳香油挥发性强、易溶于有机溶剂。因此可以采用蒸馏法，萃取法、压榨法等进行提 取。 1、蒸馏法：植物芳香油提取的常用方法。蒸馏法的类型水中蒸馏水上蒸馏水汽蒸馏特点原料放在蒸馏容器的 水中，水要完全浸没 原料容器中水的上 方有筛板，水 量以沸腾时不 浸润原料为宜蒸馏容器下方有一个 通气孔。连接外源蒸 汽，上方有筛板，上 面放有原料玫瑰精油的提取流程：2、萃取法 植物芳香油可以溶于有机溶剂（石油醚、酒精、乙醚、戊烷等）中，对于不适于蒸馏 的原料可以采用萃取法。大致方法是将干燥的植物粉碎，用有机溶剂浸泡后，芳香油就会 溶解在溶剂中，然后蒸发掉有机溶剂就可以获得
6、植物芳香油了。 胡萝卜素的提取操作流程注意事项： 使用较高沸点的水不溶性有机溶剂作为萃取剂；在加热瓶口安装冷凝回流装置，防止 有机溶剂加热挥发；有机溶剂要能从产品中完全除去，不会影响产品质量。 3、压榨法 对于有效成分，在用水汽蒸馏法时会发生部分水解，用水中蒸馏法会产生焦糊的植物 材料，可以考虑用旋转滤膜蒸馏法或压榨法。 压榨法提取橘皮油的操作流程：回顾与总结： 五种物质的提取方法、原理与步骤提取物质提取方法提取原理步骤DNA盐析法在不同浓度的氯化 钠溶液中溶解度不同；不溶于酒精，但某 些蛋白质则溶于酒精溶解在 2mol/L 的 NaCl 溶液中 加水稀释至 0.14mol/L 的 NaCl
7、溶液使 DNA 析出、 过滤 加入冷酒精析出血红蛋白凝胶色谱 法根据相对分子质量 大小样品处理 粗提取电泳法各种分子带电性质 差异纯化 纯度鉴定玫瑰精油水蒸气蒸 馏法利用水蒸气将挥发性 较强的植物芳香油携 带出来水蒸气蒸馏 分离油层 除水过滤橘皮精油压榨法、 旋转滤膜 蒸馏法通过机械加压、压榨 出果皮中的芳香油石灰水浸泡、漂洗 压榨、过滤、静置 再次过滤胡萝卜素萃取法使提取物溶解在有机 溶剂中，蒸发后得到 浓 缩物粉碎干燥 萃取、过滤 浓缩【典型例题典型例题】例 2、请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题： （1）植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、_和_。 （2）芳香油溶解性的特点是不溶于
8、_，易溶于_，因此可用_作为提取剂 来提取芳香油。 （3）橘子果实含有芳香油，通常可用_作为材料来提取芳香油，而且提取时往往 选用新鲜的材料，理由是 _ _。 （4）对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物质获得乳状液可采用的方法 是_。 （5）得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的_层， 原因是_。加入氯化钠的作用是_。 （6）从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，此试剂的作用是_。 解析：解析：本题考查实验室提取芳香油的有关知识。（1）植物芳香油的提取可采用的方法 有压榨法、蒸馏法、萃取法.（2）芳香油溶解性的特点是不溶于水，易溶于有机溶剂，因 此可用有
9、机溶剂作为提取剂来提取芳香油。（3）一般采用新鲜的橘子皮来提取橘皮精油， 因为新鲜的材料含有芳香油多（4）除去液体中的固体常用的方法是过滤。（5）芳香油密 度比水小，且不溶于水，会浮在液体的表面。加入氯化钠会增加水层密度，使油和水分层。 （6）无水硫酸钠的作用是可以吸收芳香油中残留的水分。 答案：答案：（1）蒸馏法 萃取法 （2）水 有机溶剂 有机溶剂 （3）橘子皮 芳 香油含量较高 （4）过滤 （5）上 油层的密度比水层小 增加水层密度，使油和水分 层 （6）吸收芳香油中残留的水分知识点知识点 3 分子生物学技术分子生物学技术 （一）分子生物学进展 1944 年埃弗里实验验证 DNA 是遗传
10、物质，1953 年沃森和克里克创立 DNA 双螺旋结 构模型，奠定了现代分子生物学的基础。 基因工程技术具有巨大的潜在价值，世界各国都十分重视该技术的发展，许多成果已 经转化为生产力。我国在生物技术方面已经取得了一系列突破性的进展，如许多诊断试剂 盒的生产，以及转基因植物、转基因动物、转基因微生物的相继培育成功。（二）PCR 技术1、PCR 技术的原理及分析 （1）扩增方向：为了明确地表示 DNA 的方向，通常将 DNA 的羟基（-OH）末端称 为 3端，而磷酸基团的末端称为 5端。DNA 聚合酶不能从头开始合成 DNA，而只能从3端延伸 DNA 链，即 DNA 的合成方向总是从子链的 5端向
11、 3端延伸。（2）热变性与退火 双链 DNA 在 80100条件下成为单链，称为变性，缓慢降温过程中能重新形成双螺 旋结构，称为复性或退火，因此通过控制温度使双链 DNA 变性成为单链，快速降温使引 物与单链结合，再迅速升高温度让子链延伸。目前使用的 PCR 仪能自动控制和转换温度， 并能设定循环次数。 （3）Taq 聚合酶 Taq 聚合酶是从一种水生嗜热菌 y T1株中分离提取的。yT1是一种嗜热真菌，能在 7075环境中生长，该菌是 1969 年从美国黄石国家森林公园火山温泉中发现的。该酶的 发现解决了高温使普通的 DNA 聚合酶失活的矛盾。 2、PCR 扩增的过程 3、生物体内 DNA
12、复制与 PCR 反应的区别体内 DNA 复制PCR 反应解旋解旋酶作用下，细胞提供能 量，部分解开加热至 90，双链全部解开，不需解旋酶引物一小段 RNA单链 DNA 分子片段合成子链在引物基础上，一条链连续 合成，另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始，都是连续合成， 控制温度 72 特点边解旋边复制，半保留复制体外迅速扩增Taq 聚合酶不需要 需要循环次数受生物体自身控制30 多次相同点需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行特别提醒：DNA 母链的 3端对应着子链的 5端，即 DNA 的两条链是反向平行的。 解旋酶的作用是使 DNA 两条链的氢键断开，而 DNA 聚合
13、酶与 DNA 连接酶都可催 化形成磷酸二酯键。DNA 聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的 3羟基上，需要模板，而 DNA 连接酶连接的是两条 DNA 片段的缺口，不需要模板。 在 PCR 反应中，加入的四种脱氧核苷酸实际上是四种脱氧核苷三磷酸，既是原料， 也是能源。 在 PCR 反应中加入的 Mg2+实际上是 Taq 聚合酶的激活剂。 4、PCR 操作过程中的注意事项 （1）为避免外源 DNA 等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压 灭菌。 （2）所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20下储存。 （3）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。
14、（4）EB 是一种致癌物，在实验过程中要做好防护工作，如戴塑料膜防护手套；在紫 外灯下观察时要戴上专用护眼镜。 5、PCR 技术的应用 （1）医学上用该技术分析人的精液，对细菌、病毒感染进行早期诊断 （2）对单细胞中的 DNA 进行扩增，用于遗传病的基因诊断，并在此基础上进一步制 备无突变的 DNA 片段供遗传病患者基因治疗时使用。 （3）法医学用来鉴别罪犯或进行亲子鉴定 （4）古生物学用此技术分析古生物化石样品，追溯其生存年代或迁徙踪迹 （5）在农业生物技术中，可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等。【典型例题典型例题】例 3、在遗传病及刑侦破案中常需要对样品 DNA 进行分析，
15、PCR 技术能快速扩增 DNA 片段，在几个小时内复制出上百万份的 DNA 拷贝，有效地解决了因为样品中 DNA 含量太 低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：（1）在相应的横线上写出引物，并在复制这一步骤中将引物置于合适的位置。 （2）在相应的横线上写出循环一次后生成的 DNA 分子。 （3）若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P 标记，请分析循环一次后生成的 DNA 分子的特点： ，循环 n 次后生成的 DNA 分子中不含放射性的单链占总 单链的比例为 。 （4）PCR 反应过程的前提条件是 ，PCR 技术利用 DNA 的 原理解决了这 个问题。 （5）在对样品 DNA 进行分析的过程中发现，DNA 掺杂着一些组蛋白，要去除这些 组蛋白可加入的物质是 。 解析：解析：（1）DNA 聚合酶不能从头开始合
