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1、该技术能够快速在目标基因组的染色体中确定特异 DNA 结合蛋白的准确结合位点,ChIP 芯片也可以在一个基因组的任何感兴趣的区域内寻找染色体的结构改变。一、一、ChIP-Chip 的用途的用途(1)在基因组范围内确定基因转录因子的 DNA 结合位点和其他 DNA 结合蛋白或蛋白复合体的 DNA 结合位点。(2)染色体活性状态的定量分析。(3)组蛋白修饰的功能研究。通过用酰基化或甲基化的组蛋白的特异抗体和没有进行修饰的组蛋白的特异抗体,可以确定与组蛋白修饰有关的结合模式的变化。(4)聚合酶活性的定量分析。(5)精炼生物信息方法,用功能数据来确定启动子的位置。二、具体实验原理和实验步骤二、具体实验
2、原理和实验步骤染色质免疫沉淀芯片流程图三、三、GeneChip-TilingArray 技术简介技术简介Affymetrix 公司于 2006 年 1 月 24 日宣布推出 GeneChip(R)人类和鼠源嵌合芯片(TilingA,ray)系列产品。该系列芯片研究范围大大超出已知编码蛋白序列,可以对整个人类和小鼠基因组进行系统的研究。研究人员可以利用这一芯片对转录因子和其他蛋白结合结构域进行研究。最近,更有研究人员利用Affymetrix 的嵌合芯片在过去认为是垃圾 DNA 的区域中间找到了许多以前从未发现过的转录活性区域。嵌合芯片(TilingArray)是迄今为止分辨率最高的基因芯片类型,
3、其探针设计几乎涵盖了目标 DNA 的全部序列。迄今为止,Affymetrix 公司已经开发出了人、小鼠、酵母、线虫、拟南芥等模式生物的全基因组Tiling 芯片,为全基因组规模上研究目的蛋白与核酸的相互作用提供了强有力的分析工具。GeneChip-TilingArray 除了全基因组芯片外,还包括了专门应用于 ChIPChip 技术中的人启动子和小鼠启动子两款芯片,探针设计覆盖了转录起始位点附近 10kb 的范围,可针对肿瘤相关的 1 300 个基因,覆盖范围更是增加到了 12.5kb。1882 年,德国细胞学家弗莱明首次公开发表了细胞有丝分裂现象的观察结果,他的工作也被看作是科学史上最重要的
4、发现之一。除了对有丝分裂进行描绘以及命名之外,弗莱明还对这一过程中看似起关键作用的物质染色质作了标记。目前,它是生物学两个最热门领域基因组学和蛋白组学研究关注的焦点。但是,不同之处在于:弗莱明采用的是光学显微镜和装有少量苯胺染色的玻璃瓶对其进行研究,而最新的基因组阶段的染色质研究采用的是尖端的技术染色质免疫沉淀作用测定法(ChIP)。基因组学和蛋白组学都将把染色质作为研究对象,但两个领域采用的方法各异。在基因组学研究中,研究人员通常从一个蛋白质开始研究,采用 ChIP 去找出与基因组关联的蛋白质。而蛋白组学研究采用的是反向方法,先用一个特殊的 DNA 序列作为寻找蛋白质的诱饵;然后用 ChIP
5、 去证实:那些蛋白质就是在体内与 DNA 序列相关联的蛋白质。四、使用说明:四、使用说明:1. 样品超声处理条件的优化:样品超声处理条件的优化:A. 准备适量冰浴预冷的 PBS,以及 100mM PMSF。将 SDS Lysis Buffer 适当温浴,使其中的 SDS 充分溶解,并混匀。B. 将细胞培养于 10cm 细胞培养皿中,细胞培养液的用量为 10 ml。在预期发生目的蛋白和基因组DNA 结合的时间点,直接在细胞培养液中加入适量甲醛,轻轻混匀,至最终浓度为 1%。随即在 37孵育 10 分钟,以交联目的蛋白和相应的基因组 DNA。例如,对于常规的每个 10cm 细胞培养皿中加入 10
6、ml 细胞培养液的情况,需加入 270 微升 37%甲醛。请注意尽量使用高质量的在有效使用期限内的甲醛。细胞也可以培养于 6cm 细胞培养皿中,相关溶液的用量需按照比例进行相应调整。C. 加入 1.1ml Glycine Solution (10X),轻轻混匀。室温放置 5 分钟。D. 将有细胞样品的培养皿置于冰浴上。吸尽含甲醛和 glycine 的培养液,尽量保持没有液体残留。E. 在上述室温放置 5 分钟期间,用冰浴预冷的 PBS 稀释 100mM PMSF 至 1mM,即配制成冰浴预冷的含 1mM PMSF 的 PBS。PMSF 水性溶液一定要新鲜配制,其在水相中的半衰期约为 30 分钟
7、。F. 加入 5-10ml 冰浴预冷的含 1mM PMSF 的 PBS,洗涤细胞,吸尽液体,尽量保持没有液体残留。G. 再加入 5-10ml 含冰浴预冷的 1mM PMSF 的 PBS,进一步洗涤细胞,吸尽液体,尽量保持没有液体残留。H. 加入 1ml 冰浴预冷的含 1mM PMSF 的 PBS,用细胞刮子刮下细胞,收集至离心管中。如果细胞可以用枪吹打下来,也可以用枪吹打。对细胞进行计数,分装成每管大约 100 万细胞。I. 4,800-1000g 离心 1-2 分钟,以充分沉淀细胞。如果发现沉淀不充分,可以适当延长离心时间。吸尽上清,尽量减少液体残留。J. 配制适量含有 1mM PMSF 的
8、 SDS Lysis Buffer。上一步骤的 100 万细胞沉淀用 0.2ml 含有 1mM PMSF 的 SDS Lysis Buffer 重悬。K. 在冰浴上孵育 10 分钟,以充分裂解细胞。L. 超声处理,以剪切基因组 DNA,使 DNA 大部分断裂成 200-1000bp 大小,如果能把大部分控制在 400-800bp 则更佳。超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中,并且处于较低温度。超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的 DNA 琼脂糖凝胶电泳检测。超声处理的条件通常可以设置为 10 秒每次,共 3-4 次,功率为 50W 时设置为最大功率的 30%,采用 2mm 超声头。不同
9、的超声处理仪器的设置不太一样,摸索超声条件时,可以先固定其他条件,先确定每次超声多长时间不会导致明显发热,然后摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组 DNA 断裂成 200-1000bp 大小。需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定,否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。M. 在 0.2ml 经过超声处理的样品中加入 8 微升 5M NaCl,混匀。65加热 4 小时,以去除蛋白和基因组 DNA 之间的交联。N. 加入等体积的 Tris 平衡苯酚,vortex 剧烈混匀,随后 4,12000g 左右离心 5 分钟。吸取上清至另一离心管中。O. 加入
10、等体积氯仿,vortex 剧烈混匀,随后 4,12000g 左右离心 5 分钟。吸取上清至另一离心管中。说明:说明:上述步骤 1N 和 1O 的酚氯仿抽提可以使用 DNA 纯化试剂盒进行操作。例如碧云天的 PCR/DNA 纯化试剂盒(D0033)。P. 取少量通过酚氯仿抽提或 DNA 纯化试剂盒获得的液体,对于酚氯仿抽提产物可以取 5-10 微升,对于 DNA 纯化试剂盒纯化产物可以取 2-5 微升,进行琼脂糖凝胶电泳,观察超声处理对于基因组 DNA的剪切效果。2. 染色质免疫沉淀:染色质免疫沉淀:A. 在对样品超声处理条件进行优化后,对于待检测样品按照步骤 1A-1K 进行操作,并参考步骤
11、1L进行超声处理。B. 随后对于经过超声处理的样品在 4,12000-14000g 离心 5 分钟。取上清(约 0.2ml)至一 2ml 离心管中,置于冰浴。C. 配制适量含有 1mM PMSF 的 ChIP Dilution Buffer。加入 1.8ml 含有 1mM PMSF 的 ChIP Dilution Buffer 以稀释经过超声处理的样品,使最终体积为 2 毫升。D. 取出 20 微升样品作为 Input 用于后续检测。其余近 2ml 样品加入 70 微升 Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA(其中约 35 微升为沉淀,35 微升为液体),在
12、4缓慢转动或摆动混匀 30 分钟。此步骤的目的是减少 Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA 和目的蛋白或目的 DNA 序列的非特异性结合。E. 4,1000g 左右离心 1 分钟,将上清转移至一个新的 2 毫升离心管中。F. 加入适量一抗,一抗的用量可以参考抗体的说明书。如果抗体的说明中未给出用于 ChIP 的稀释比例,可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例。通常一抗的用量为 0.5-1 微克。4缓慢转动或摆动混匀过夜。可以不加抗体作为阴性对照,或用无关的抗体作为阴性对照,同时可以用没有细胞样品的溶液作为空白对照。G. 加入 60 微升 Protein A+G A
13、garose/Salmon Sperm DNA(其中约 30 微升为沉淀,30 微升为液体),在 4缓慢转动或摆动混匀 60 分钟,以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。H. 4,1000g 左右离心 1 分钟。非常小心地去除液体,切勿触及沉淀。随后依次用如下溶液对沉淀进行洗涤,每次洗涤液的用量为 1ml,每次在 4缓慢转动或摆动洗涤 3-5 分钟,随后 4,1000g 左右离心 1 分钟。非常小心地去除液体,切勿触及沉淀。a. Low Salt Immune Complex Wash Buffer 洗涤一次。b. High Salt Immune Complex Wash Buffer 洗涤一
14、次。c. LiCl Immune Complex Wash Buffer 洗涤一次。d. TE Buffer 洗涤两次。说明:完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于 PCR 扩增目的基因序列或用 Southern 检测目的基因序列,或者用于 Western 检测等。3. PCR 扩增目的基因序列(如果扩增目的基因序列(如果 ChIP 产物用于检测目的基因序列):产物用于检测目的基因序列):A. 新鲜配制适量 Elution buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3)。B. 完成步骤 2H 后,即完成所有洗涤步骤后,加入 250 微升 Elution buffer。Vortex
15、 混匀,室温转动或摆动继续洗脱 3-5 分钟。C. 1000g 左右离心 1 分钟,将上清转移到一新的离心管中。沉淀中再加入 250 微升 Elution buffer。Vortex 混匀,室温转动或摆动继续洗脱 3-5 分钟。D. 1000g 左右离心 1 分钟,取出上清。和上一步骤,即步骤 3C 中获得的上清合并。共计约 500微升上清。E. 在 500 微升上清中加入 20 微升 5M NaCl,混匀。65加热 4 小时,以去除蛋白和基因组 DNA之间的交联。对于步骤 2D 获得的作为 Input 的 20 微升样品,加入 1 微升 5M NaCl,混匀,65加热 4小时,同样用于去除蛋
16、白和基因组 DNA 之间的交联。此步骤完成后可以继续进行后续步骤,也可以先-20冻存,第二天继续后续步骤。说明:说明:此时的样品已经可以用于 PCR,可以尝试使用 1、2、5 或 10 微升样品作为模板用于 PCR检测目的基因。此时 PCR 的效果和可能被沉淀下来的 DNA 的量,以及整个 PCR 扩增体系是否容易扩增目的基因有关。如果发现 PCR 效果欠佳,可以考虑通过后续的纯化步骤,纯化并浓缩样品,然后再进行PCR 检测。F. 在约 520 微升样品中加入 10 微升 0.5M EDTA,20 微升 1M Tris pH 6.5 和 1 微升 20mg/ml 蛋白酶 K。混匀后 45孵育 60 分钟。G. 加入等体积 Tris 平衡苯酚,vortex 剧烈混匀,随后 4,12000g 左右离心 5 分钟。吸取上清至另一离心管中。H. 加入等体积氯仿,vortex 剧烈混匀,随后 4,12000g 左右离心 5 分钟。吸取上清至另一离心管中。I. 加入 20 微克 glycogen 或 yeast tRNA,加入 1/10 体积的