《广东工业大学-生化分离技术-Doc1》由会员分享，可在线阅读，更多相关《广东工业大学-生化分离技术-Doc1（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、下游技术 第一章第一章 提取与沉淀分离技术提取与沉淀分离技术 生物大分子生物大分子是指在生物体内存在的具有特殊生物学功能的高分子化合物，主要包括是指在生物体内存在的具有特殊生物学功能的高分子化合物，主要包括 蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类蛋白质、酶、核酸、多糖和脂类。 提取的概念：在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充提取的概念：在一定的条件下，用适当的溶剂（溶液）处理原料，使欲分离物质充 分分溶解溶解到溶剂（溶液）中的过程。也叫抽提。到溶剂（溶液）中的过程。也叫抽提。 提取提取 液液-固提取固提取 液液-液提取（萃取）液提取（萃取） 细胞破碎细胞破碎 定义：细胞破碎是指选
2、用物理、化学、酶或机械的方法来破坏定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁细胞壁或或细胞膜细胞膜 目的：目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。 对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。对于胞内产物需要收集菌体或细胞进行破碎。 细胞壁结构对破碎的影响细胞壁结构对破碎的影响 细胞破碎的阻力主要来自于细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁细胞壁。 不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易不同细胞壁的结构和组成不完全相同，故细胞壁的机械强度不同，细胞破碎的难易 程度也就不
3、同。程度也就不同。 几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链；几乎所有细菌的细胞壁都是由肽聚糖组成，它是难溶性的聚糖链； 相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；相邻聚糖链上的短肽又交叉相联，构成了细胞壁的三维网状结构，包围在细胞周围；使细胞具有一定的形状和强度。使细胞具有一定的形状和强度。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决 于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。 *（细胞破碎方法（细
4、胞破碎方法 机械破碎法机械破碎法 高速组织捣碎机高速组织捣碎机 匀浆器匀浆器 研磨器研磨器 物理破碎法物理破碎法 化学破碎法化学破碎法 酶学破碎法酶学破碎法 （物理破碎法的分类（物理破碎法的分类 温度差破碎法温度差破碎法 把待破碎的样品通过把待破碎的样品通过温度的反复变化温度的反复变化而使细胞破碎。而使细胞破碎。压力差破碎法：通过压力差破碎法：通过压力的变化压力的变化，使细胞内与细胞外所受的压力不同，而使细，使细胞内与细胞外所受的压力不同，而使细 胞破碎。胞破碎。 超声波破碎法超声波破碎法 通过通过超声波超声波的作用，使细胞结构解体，而使细胞破碎。的作用，使细胞结构解体，而使细胞破碎。化学破碎
5、方法化学破碎方法 化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透 过性改变。过性改变。 常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。 十二烷基硫酸钠：十二烷基硫酸钠：SDS 酶学破碎方法酶学破碎方法 酶学破碎方法：利用酶学破碎方法：利用溶解细胞壁溶解细胞壁的酶的酶(外加的或细胞本身存在的酶外加的或细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，处理菌体细胞， 使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细
6、胞膜 分为：外加酶制剂和自溶法。分为：外加酶制剂和自溶法。 但对于革兰氏阴性菌，单独采用但对于革兰氏阴性菌，单独采用溶菌酶溶菌酶无效果，必须与无效果，必须与螯合剂螯合剂EDTA 一起使用一起使用。原其细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子。原其细菌的壁外层结构通常靠二价阳离子 Ca2+或或 Mg2+结合脂多糖结合脂多糖 和蛋白质来维持，一旦和蛋白质来维持，一旦 EDTA 将将 Ca2+或或 Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细 胞壁外层膜出现洞穴。胞壁外层膜出现洞穴。提取方法1.盐溶液提取法盐溶液提取法 盐溶：在低浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而盐
7、溶：在低浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加增加。 盐析：当盐浓度达到某一界限后，蛋白质的溶解度随盐浓度升高而盐析：当盐浓度达到某一界限后，蛋白质的溶解度随盐浓度升高而降低降低。2.酸溶液提取法酸溶液提取法 3.碱溶液提取法碱溶液提取法 4.有机溶剂提取法有机溶剂提取法 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等。常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、丁醇等。影响提取的因素（影响提取的因素（P8） 1.溶解度溶解度 2.扩散速度扩散速度 3.温度温度 4.pH 值值 5.提取液的体积提取液的体积 等电点：在某一个特定的等电点：在某一个特定的 pH 值条件下，分子上所带的值条件下，分子上所带的正、负电
8、荷相等正、负电荷相等，净电荷为零，此，净电荷为零，此 时的时的 pH 值即为该分子的等电点。蛋白质在等电点下值即为该分子的等电点。蛋白质在等电点下溶解度最小溶解度最小第三节第三节 沉淀分离沉淀分离 生物大分子的分离方生物大分子的分离方 沉淀分离沉淀分离 盐析沉淀法盐析沉淀法 等电点沉淀法等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 金属盐沉淀法金属盐沉淀法 复合沉淀法复合沉淀法 选择性选择性 变性沉淀法变性沉淀法 层析分离层析分离 电泳分离电泳分离 超离心分离超离心分离 沉淀分离的定义：通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶液中的沉淀分离的定义：通过改变某些条件或添加某种物质，使某溶质在溶
9、液中的溶解度溶解度 降低降低，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离。，从溶液中沉淀析出，而与其他溶质分离。 （P10）1. 盐析原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。在某一浓盐析原理：蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。在某一浓 度的盐溶液中，度的盐溶液中，不同蛋白质的溶解度各不相同不同蛋白质的溶解度各不相同，由此可达到彼此分离的目的。，由此可达到彼此分离的目的。 反离子作用改变了蛋白质分子表面的电荷。反离子作用改变了蛋白质分子表面的电荷。 离子的存在使蛋白质的水化膜改变。离子的存在使蛋白质的水化膜改变。 盐的选择盐的选择 蛋白质和酶的盐析通常采用蛋白质和酶的盐析通常采用中性
10、盐中性盐。 其中在实际中应用最广的是其中在实际中应用最广的是硫酸铵硫酸铵（因为硫酸铵有温度系数小而溶解度大的优点，（因为硫酸铵有温度系数小而溶解度大的优点， 并且硫酸铵分段盐析效果比其它盐好，不易引起蛋白质变性。并且硫酸铵分段盐析效果比其它盐好，不易引起蛋白质变性。 ） 盐析时的注意事项盐析时的注意事项 1.添加的硫酸铵的添加的硫酸铵的纯度要高纯度要高。并要使其充分溶解。并要使其充分溶解。 2.在同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用在同一溶液中欲分离几种蛋白质时，可采用分段盐析分段盐析的方法。的方法。3.盐析操作一般可在盐析操作一般可在室温室温下进行，而某些对热特别敏感的酶，则应在下进行，而某
11、些对热特别敏感的酶，则应在低温低温条件下进行。条件下进行。4.选择适当的蛋白质浓度，避免共沉淀作用。选择适当的蛋白质浓度，避免共沉淀作用。 5.沉淀要脱盐纯化。沉淀要脱盐纯化。 等电点沉淀法等电点沉淀法 沉淀原理：利用蛋白质在沉淀原理：利用蛋白质在等电点时溶解度最低等电点时溶解度最低以及以及不同的蛋白质具有不同的等电点不同的蛋白质具有不同的等电点 这一特性，将不同蛋白质进行分离。这一特性，将不同蛋白质进行分离。 在实际使用时等电点沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。在实际使用时等电点沉淀法经常与盐析法或有机溶剂沉淀法联合使用。 加酸或加碱调节加酸或加碱调节 pH 值过程中，要防止局部过
12、酸或过碱。值过程中，要防止局部过酸或过碱。 、 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 沉淀原理：利用不同蛋白质沉淀原理：利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同在不同浓度的有机溶剂中的溶解度不同而使蛋白质分离。而使蛋白质分离。优点：分辨力比盐析法好，溶剂容易除去且可回收。优点：分辨力比盐析法好，溶剂容易除去且可回收。 缺点：易使蛋白质和酶变性缺点：易使蛋白质和酶变性 操作要点 有机溶剂：常用乙醇和丙酮有机溶剂：常用乙醇和丙酮 温度：低温温度：低温 离子强度：加入盐（减少蛋白质变离子强度：加入盐（减少蛋白质变 性，提高分离效果）性，提高分离效果） 的的 浓度不宜太高浓度不宜太高 第二章 过滤与膜
13、分离技术的定义过滤与膜分离技术的定义 粗滤和部分微滤采用高分子膜粗滤和部分微滤采用高分子膜以外以外的物质作为过滤介质，称为非膜过滤，简称为过的物质作为过滤介质，称为非膜过滤，简称为过 滤。滤。 大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称大部分微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜为过滤介质，称 为膜过滤，又称为膜分离技术。为膜过滤，又称为膜分离技术。 . 加压膜分离加压膜分离 1 1） 微滤微滤 2 2）超滤）超滤 3 3）反渗透）反渗透 电场膜分离 2） （1）电渗析）电渗析 离子交换膜电渗析离子交换膜电渗析 第三章第三章 萃取分离技术萃取分离技术
14、 萃取分离原理：组分在两个萃取分离原理：组分在两个互不相溶的液相互不相溶的液相中的中的溶解度溶解度不同。不同。 萃取分离特点：简便萃取分离特点：简便 、快速、应用广、快速、应用广 萃取萃取是生物分离中常用的单元操作是生物分离中常用的单元操作 分配系数分配系数 衡量萃取体系是否合理的重要参数：衡量萃取体系是否合理的重要参数：ky/x Y-平衡时溶质在轻相中的浓度平衡时溶质在轻相中的浓度 X-平衡时溶质在重相中的浓度平衡时溶质在重相中的浓度 双相萃取利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法 可以构成双水相的体系有：可以构成双水
15、相的体系有： 离子型高聚物非离子型高聚物离子型高聚物非离子型高聚物 聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇葡聚糖 高聚物相对低分子量化合物高聚物相对低分子量化合物 聚乙二醇硫酸铵聚乙二醇硫酸铵超临界流体萃取超临界流体萃取 超临界流体：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。超临界流体：当一种流体处于其临界点的温度和压力之下，则称之为超临界流体。 特点：密度接近液体萃取能力强特点：密度接近液体萃取能力强粘度接近气体传质性能好粘度接近气体传质性能好扩散系数大，是液体的近扩散系数大，是液体的近 100 倍。倍。 正是由于超临界流体具有的正是由于超临界流体具有的密度高、粘度小、扩散系数大、介电常数
16、大密度高、粘度小、扩散系数大、介电常数大等特点，因等特点，因 此具有此具有很好的萃取能力很好的萃取能力。 超临界二氧化碳萃取超临界二氧化碳萃取 临界点：临界点：T：304.1 K P：73.8 bar 优点：优点： 临界条件温和临界条件温和 产品分离简单产品分离简单 无毒、无害无毒、无害 不燃不燃 无腐蚀性无腐蚀性 价格便宜价格便宜 反胶束萃取反胶束萃取 表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体表面活性剂在非极性有机溶剂中形成的一种聚集体 当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活性剂会在水溶液中形成聚当表面活性剂浓度超过临界微团浓度时，表面活性剂会在水溶液中形成聚 集体集体 胶团和反胶团胶团和反胶团 反胶团：反胶团： 表面活性剂的极表面活性剂
