微生物在药学中的应用

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1、第一节微生物发酵制药 一、微生物发酵的概念及分类 (一)微生物发酵的概念 所谓发酵( fermentation)原来是指在厌氧条件下酵母菌分解碳水化合物释放能量以及得到产 物的过程。随着科学技术的进步，尤其是分子生物学的发展，赋予了发酵新的更广泛的内 涵，即发酵是借助于生物细胞(含动、植物细胞和微生物)在有氧或无氧条件下进行生命活 动来制备产物的所有过程。微生物发酵就是利用微生物生命活动产生的酶对各种原料进行酶加工以获得所需 产品的过程。它已成为一门工程学科，其利用的细胞一般都经过人工改造，然后再通过 控制培养条件使其最大限度地生产目的产物。（二）微生物发酵的类型由于微生物代谢类型的多样化，不

2、同的微生物对同一物质进行发酵或用同一种微生物 在不同的条件下进行发酵，可以获得不同的产物。因此，发酵的类型也多种多样。常见的 微生物发酵类型有几种工业生产中常将发酵类型结合使用，如液体深层发酵、需氧浅层发 酵。 二、微生物发酵制药的基本流程 微生物的发酵技术一般分为上游技术、中游技术和下游技术二个阶段。上游技术是指 发酵生产用菌种的选育；中游技术是指微生物在适宜条件下的培养过程，即发酵阶段;下游 技术是指从发酵培养液中分离、提取、精制加工有关产品的过程，即提取阶段。2.微生物发酵培养的方法 现代发酵工业上常用的培养方法有分批发酵法、连续发酵法、 补料分批发酵法和固定化细胞发酵法。3，发酵工艺控

3、制 微生物发酵生产的水平最基本的是取决于生产菌种的性能，而 优良菌种还需要有最佳的环境条件即发酵工艺加以配合，使其处于最佳的产物合成状 态，才能取得优质高产的效果。(l)无菌操作:发酵过程中发生杂菌污染影响产品生成量，因此，在移种、取样等过 程中应进行严格的无菌操作。（2）营养物质:发酵中微生物所需要的营养必须充足。因此，应定时抽取发酵液对 其营养物质进行监测，及时添加或调整各种营养物质，确保微生物细胞的快速生长及 代 谢活动。（3）溶解氧:氧气的供给往往是需氧深层发酵能否成功的重要限制因素。氧在培养 基中的溶解度极低，即使培养基是被空气饱和的，其中溶解氧依然很少。生产中大多是往 发酵罐内通人

4、无菌空气并加以搅拌，来维持溶解氧水平。(4)通气和搅拌:通气的目的是为微生物细胞提供所需要的氧。搅拌除有利于增加 “培养基中溶解氧的浓度，提高通气效果外，还有利于热交换，使培养液的温度，致;有利 于营养物质和代谢物的分散均匀。(5)温度:发酵过程中的温度可影响微生物的生长、产物的形成、发酵液的物理性质、 生物合成的方向等，而最适发酵温度又因菌种、培养基成分和浓度、菌体生长阶段、培养 条件的不同有所差异。在抗生素发酵中，选择最适发酵温度主要从两方面考虑，即微生物 生长的最适温度和代谢产物合成的最适温度，因为这两个阶段所需温度往往不同，如青霉 素产生菌生长的最适温度为 30，而产生青霉索的最适温度

5、是 24.7:因此，实践中应结 合考虑具体情况进行最适温度的选择控制。(6)酸碱度:各种微生物都有自己生长与生物合成的最适酸碱度，有些生长繁殖阶段与 产物形成阶段所需的最适 ph 是不一致的。如链霉菌生长最适 pH 为 6.36.9，而链霉索形成 的最适 pH 为 6. 77. 3。发酵过程中培养基的酸碱度会随多种因素的影响而发生变化，因此 在发酵过程中应定时测定，并以生理酸性物质(如硫酸钱等)或生理碱性物质（如氨水等） 调节 pH，以适应微生物生长和产物合成的需要。(7)泡沫:通气、搅拌、微生物代谢等多方面因素均可造成泡沫的形成，这是发酵中的正常现象，但过多的泡沫会影响生产，如会占据空间而使

6、发酵液减少、会增加杂菌污染机 会、影响微生物的呼吸而使其代谢异常等。生产中常通过机械的强烈振动或加人消沫剂来 除去泡沫。（8）杂菌污染:非发酵用微生物进人发酵系统会影响发酵的正常进行。因此在发酵的 进程中，要及时发现和消除杂菌污染。监测方法是在发酵的各个阶段定期从取液孔取出一 定量的发酵液进行检杳，发现污染及时采取相应的处理措施。(9)发酵终点的判断;发酵过程中通过定期取样，测定产物的含量、发酵液的酸碱度、 含糖量和含氮量、菌体量及菌体形态的观察等，判断合适的放罐时机。一般放罐应在产物 产量的高峰期，过早或过迟都会影响产物的产量。 二)下游加工过程提取阶段发酵液组成非常复杂，其中微生物细胞碎片

7、、杂蛋白质、无机离子、代谢产物等杂质含 量很高，发酵目的产物所占比例极少，大多低于 10% ,各种抗生素的浓度不足 1 %。提取阶 段的主要任务就是采取适宜的方法技术，从发酵液中分离得到符合要求的发酵产品。由于发酵生产的目的产物不同(如有的需要菌体、有的需要初级代谢产物、有的需要 次级代谢产物)，对产品质量的要求也有所差异，因此获取产品的方法技术不尽相同，但通 常按生产过程的顺序将提取阶段分为四个环节，即发酵液的预处理、提取、精制、成品加 工等。1.发酵液的预处理无论发酵产物是在发酵液中还是在微生物细胞内，因发酵液体积 大，且杂质含量高，首先都必须进行发酵液的预处理，其目的有三:将发酵液的固相

8、与液 相分开;尽可能地使发酵目的产物转人以后要处理的液相中;去除发酵液中的大部分杂质。发酵液预处理过程包含以下基本内容: (1)菌体分离:离心和过滤的目的是将发酵液中的菌体从液相中分离出来。常用的分 离方法是采用离心分离和过滤。对于发酵液中的细菌和酵母菌一般采用高速离 心法进行分离。对于细胞体积较大的丝状菌包括霉菌和放线菌的分离则采用过 滤方法进行分离。 (2)破碎细胞与细胞碎片的分离:其目的是得到目标产物。细胞破碎常用高压匀浆法和 研磨法等。细胞碎片的分离方法常采用离心分离法。 (3)去除蛋白质:目的是去除发酵产品以外的可溶性蛋白质。常用方法有等电点法或加 热法。 (4)调整发酵液的酸碱度和

9、温度:其目的一方面通过调整发酵液的酸碱度和温度，尽可能 地使发酵产物转人便于以后处理的相中(多数是液相)。另一方面尽量避免因温度及酸碱度 过高或过低引起发酵产物的破坏或损失，保证发酵产物的质量。(5)除去金属离子、热原质等有机杂质:发酵液中存在重金属离子、色素、热原质和毒性 物质，直接影响发酵产物的质量和收获率，也影响发酵产物的提取和精制，一定要予以去 除。 2.发酵产物的提取(初步纯化) 发酵产物的提取方法很多，归纳起来有以下几种3.发酵产物的精制(高度纯化)生产实践中，通常采用层析法来分离和精制浓度比 较低的产物。常用的层析技术有吸附层析法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层 析法等。

10、以上各提纯、精制方法，还有蒸馏分离(对液体混合物分离或从溶液中回收某些溶剂 的方法)、膜分离法(物质透过或被截留于膜的“筛分离”方法)，均可在提纯、精制过程中 使用，实际工作中，常需根据目标产物的特性来选用不同的合适方法，并需多次分离、提 纯，最终达到精制目的。4.成品加工根据产品应用要求，利用浓缩、结晶、干燥等技术对已纯化的产物作最后 加工处理，以获得符合质量要求的产品。浓缩的目的是将低浓度的溶液除去一定量的溶剂 变成高浓度的溶液;结晶可使溶质从溶液中析出呈晶体状态;干燥的目的是除去发酵产品中的 水分。常用浓缩、结晶、于燥方法。加工完成后的产品，应进行有关产品的纯度、稳定性和活性等方面的检测

11、，以确保 产品的质量。通常需从下列两个方面进行检验。发酵产物经过上述分离、提取和精制的各个过程，经检验达到规定的纯度、含量等标 准。然后进行分装。根据不同的发酵产物的性质、特点，采用不同的容器将产品分装成便 于储藏和运输的形式。三、微生物发酵制药举例(一)撇生物发酵产业的发展状况 葡萄、梨等水果在自然条件下会发酵产生酒，这一自然现象早在公元前 4039 世纪已 为人类所了解并且用于酿酒。1857 年，著名的法国生物学家 Fasterur 通过实验证明酒的发 酵是由活酵母引起的;1897 年，德国的 Edward Bunchner 又进一步证明了酵母对发酵的作用: J 从此人类对发酵的木质才开始

12、有了认识。 从 19 世纪到 20 世纪的 30 年代末，微生物培养技术不断改进，促进了新的发酵产品的 不断出现，如乳酸、乙酸、柠檬酸、淀粉酶和蛋自酶等也相继问世，但此时的发酵生产工 艺简单、规模小、操作粗放，常常限制了口的产物的产量，也难以满足高品质的要求。1929 年 Fleeting 发现了青霉素,940 年才开始少量生产，且生产技术水平低下。由于第 二次世界大战的需要，迫使人们对发酵技术进行深人的研究。人们开始改变固体表面培养 手段，逐步发展液体深层培养技术。为了解决深层培养的技术要求，开发了机械搅拌式的、 可通人无菌空气的密封式发酵罐。利用发酵罐技术，再配以离心，溶媒萃取和冷冻十燥等

13、 技术，使青银素的发酵效价得到了显著提高。随后链霉素、金霉素等抗生素的相继问世， 抗生素工业迅速发展，带动微生物发酵工业进人了一个崭新的发展阶段，同时也带动了其 他发酵产品的发展:随着生物化学技术的进步，人们对发酵机制及代谢调节做了深人研究， 才有了 20 世纪 50 年代谷氨酸的产业化生产，以及随后采用营养缺陷及类似物杭性变异菌 株进行赖氨酸、苏氨酸等生产。 20 世纪六七十年代是现代微生物 r 业极其迅猛发展的年代，这个时期的特点是产品 类型多，不但有初级代谢产物，如氨基酸、酶制剂、有机酸等，也有次级代谢产物，如抗 生素、多糖等，还有微生物转化的苗体化合物的微生物加 I_p 在这一时期，发

14、酵技术和工 艺、优良生产菌种的选育技术有 r 较大的发展，新产品、新技术、新工艺、新设备不断出 现，并得到了广泛应用、使发酵工业有了巨大变化。 1953 年，Watson 和 Crick 发现 DNA 双螺旋结构，为基因重组莫定了基础。到 20 世纪 70 年代在实验室中实现了基因转移，可以按照人们的意志把外来目的的基因克隆到容易大 规模培养的微生物细胞中，并且通过微生物的大规模培养，以往只有动物或植物才能生产 的物质，如胰岛素、干扰素、白细胞介素和多种细胞生长因子等均可利用基因工程菌进行 大量生产。基因工程、蛋白质工程、细胞融合等技术为人们开创了构建新的具有各种生产 能力、性能优良的物种的新

15、天地，也为发酵工程产品增加了许多新的内容，使现代发酵产 品的发酵水平大大提高。 近年来，由下代谢调控技术、连续发酵技术、高密度培养技术、固定化增殖细胞技术、 反应器设计、发酵与分离偶联技术、在线检测技术、自控和计算机控制技术、产物的分离 纯化等所需技术的发展，使发酵工程的操作达到了一个新的高度，使得发酵工业的自动化、 连续化成为可能。(二)常见的医药发酵产品 随着微生物学基础理论和实验技术的发展，微生物在药学领域中的应用越来越广泛。 在医药生产中已广泛应用微生物发酵来制备各种药物，并且该领域形成了一门独立的微生 物药物学科。 医学上常见的微生物发酵制品有抗生素、维生素、氨基酸、酶和酶抑制剂以及

16、其他微 生物制剂(如酵母片、乳酶生、肌昔,ATP、辅酶 A 等核酸类药、生物碱、右旋糖昔)等。这里 将对抗生素、维生素、氨基酸等发酵产品作简单介绍。 1.抗生素 (1)抗生素的概念:抗生素是生物(包括微生物、植物和动物)在其生命活动过程中所产生 的(或由其他方法获得的)，能在低微浓度下有选择性地抑制或影响他种生物机能的有机物 质。临床治疗中所用的抗生素主要是由微生物产生的、对其他微生物及肿瘤细胞有选择性抑制作用的天然有机化合物。 (2)常见抗生素的种类:迄今为止已从自然界中发现和分离的抗生素已达 10 000 多种， 实际用于生产和医疗上的抗生素约一百多种，连同各种半合成衍生物及盐类共约三百余种。 抗生素种类繁多，性质复杂，用途又是多方面的，目前尚无较完善的系统分类方法。习惯 上以产生来源、作用对象、作用机制、化学结构等进行分类。 2.氨基酸 氨基酸是构成蛋白质的基本单位，亦是人体及动物生长代谢所需要的营养物 质，具有重要的生理作用，在食品、饲料、医药、化工等工.业和农.业上也有广泛的用途。 早期(182