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1、1实验二实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其 SDS聚聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其丙烯酰胺凝胶电泳检测及其 Western blotting 鉴定鉴定一、一、实验内容实验内容1利用机械破碎和高速离心分离等手段,从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白。2采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量。3. 对以上蛋白提取液进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。4. 将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行 Western blotting 鉴定。二、二、实验目的和要求实验目的和要求1了
2、解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法。2熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理,并根据实验结果,比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。3掌握 SDS-PAGE 的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法,并根据电泳结果,比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。4掌握 Western blotting 操作方法。三、三、实验仪器、材料和试剂实验仪器、材料和试剂(一)仪器(一)仪器微量移液枪及枪头、微量离心管(又称 Eppendorf 管) 、50ml 离心管、常用玻璃器皿(见表 1) 、台式天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、垂直式电泳槽装置、凝胶成像系
3、统。(二)试剂准备(二)试剂准备1Buffer I(2000ml):20mM Tris-Cl, pH8.0 。22Buffer II(500ml):Buffer I 含有 0.5M NaCl。四、实验操作四、实验操作(一)动物肌肉蛋白的提取(一)动物肌肉蛋白的提取1称取新鲜的淡水鱼或海水鱼剔除鱼鳞、鱼刺及脂肪取肌肉,用刀切碎,称取 3g 左右,加入 30 ml 左右冰冷的 Bufffer I(鱼肉g:Bufffer Iml=1:10) ,在捣碎机中捣碎成匀浆。2将以上匀浆转入 50ml 离心管中,在 4下,10000g,离心 15min,将上清和沉淀分开。3上清用四层纱布进行过滤除去脂肪,滤液
4、即水溶性蛋白提取液(留样留样(1.5ml) 、量体积、测蛋白含量、量体积、测蛋白含量、SDS 化)化)4在以上沉淀中,加入 30 ml 冰冷的 Bufffer I,重悬沉淀,在 4下,10000g,离心 15min, 取沉淀。5重复操作 4 一次。6在以上沉淀中,加入 30 ml 冰冷的 Buffer II,重悬沉淀,再次用组织捣碎机进行捣碎。7将以上匀浆转入 50ml 离心管中,在 4下,10000g,离心 15min,将上清和沉淀分开。上清即为盐溶性溶性蛋白提取液(留样(留样(1.5ml) 、量体积、测蛋白含量、量体积、测蛋白含量、SDS 化)化)(二)蛋白含量测定(二)蛋白含量测定(紫外
5、吸收法)紫外吸收法)取适量的样品提取液(以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液) ,根据蛋白质浓度,用 Buffer I 适当稀释后,用紫外分光光度计分别在 280 nm 和 260 nm波长下读取吸光度,以 Buffer I 为空白调零。结果计算:蛋白质浓度= n (1.45 A2800.74 A260) (mgmL)式中:l.45 和 0.74 为校正值;3A280为蛋白质溶液在 280nm 处的吸光度;A260为蛋白质溶液在 260nm 处的吸光度;n 为稀释倍数。(三)蛋白提取液的(三)蛋白提取液的 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳分析1 聚丙烯酰胺凝胶的配制(1)分离
6、胶(10%)的配制(10ml):ddH2O 4.0 ml30%储备胶 3.3 ml1.5M Tris-HCl(pH8.8) 2.5 ml10% SDS 0.1 ml10% AP 0.1 mlTEMED 4 l混匀后灌入玻璃板间,以水封顶,注意使液面平(凝胶完全聚合需30-60min) 。(2)积层胶的配制(5ml):ddH2O 3.4 ml30%储备胶 0.83 ml1M Tris-HCl(pH6.8) 0.63 ml10%SDS 0.05 ml10%AP 0.05 mlTEMED 5 l将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子插入玻璃板间(完全聚合需 15-30mim) 。2样品处理:
7、将样品(以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液)加入等量的2SDS 上样缓冲液,100加热 5min,离心 12000g1min,取上清作SDS-PAGE 分析,同时将 SDS 分子量蛋白标准品作平行处理。3上样:分别取 10l 处理后的样品加入样品池中,并加入 6l 蛋白标准4品作对照。4电泳:在电泳槽中加入 1电泳缓冲液,连接电源,注意正负极接向。电泳时,刚开始电压控制在 90V,当样品到达分离胶后,可将电压调至180V,电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。5染色:将胶从玻璃板中小心取出,用考马斯亮兰染色液染色。6脱色;将胶从染色液中取出,放入脱色液中,脱色至蛋白带清晰。7凝胶摄像和保存:在图像处理系
8、统下将脱色好的凝胶摄像,并利用系统软件分析实验结果,凝胶可保存于双蒸水中或 7%乙酸溶液中。(四)蛋白提取液的(四)蛋白提取液的 Western blotting 鉴定鉴定1. 将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白利用 12%SDS-PAGE 电泳分离。2. 用半干式电转移法将蛋白转至 NC 膜上。1) 将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡 10 min。2) 裁剪与凝胶大小相同的 NC 膜,在电转移缓冲液中平衡 10 min。3) 裁剪合适大小的滤纸,用电转移缓冲液浸润,按阳极、三层滤纸、NC 膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。4) 按 0.5 mA/cm2膜恒流电转移 30
9、50 min。(3)杂交a.将 NC 膜在 5%脱脂奶封闭液中室温反应 1 hr。b.TBST 漂洗 3 10 minc.转移膜至用 TBST1:100 稀释的一抗工作液(抗 MBSP 多克隆抗体)中,室温反应 1 hr。d.TBST 漂洗 3 10 mine.转移膜至用 TBST1:2000 稀释的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗兔IgG 二抗工作液中,室温反应 1 hr。f.TBST 漂洗 3 10 min。(4)显色将膜浸泡在 DAB 显色液中,待出现清晰条带后,把膜转移至蒸馏水中中止反应。(5)拍照和保存结果。附:附:溶液配制溶液配制电转移缓冲液48 mmol/L Tris 39 m
10、mol/L 甘氨酸50.01% SDS20% 甲醇TBST20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.50.15 mol/L NaCl0.05% Tween-20Western blot 封闭液:TBST + 5%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白抗体稀释液:TBST + 1%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白DAB 显色液:二氧基联苯胺,Diaminobenzidine五、注意事项五、注意事项1进行高速离心时,两个对称的离心管的重量一定要相等,离心前一定要进行平衡。2蛋白含量测定时,吸光度值最好在 1.0 之内,否则需对样品进行稀释。3为达到较好的凝胶聚合效果,缓冲液的 pH 值要准确,10%AP 在一周内
11、使用。室温较低时,TEMED 的量可加倍。4. 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性,可通过皮肤和呼吸道吸收,应注意防护。5. 在进行 Western blotting 鉴定时,蛋白 Marker 要用预染 Marker。6. 在进行 Western blotting 鉴定时,转膜方向要正确:凝胶在阴极,膜在阳极。六、六、 结果分析结果分析1. 分别计算每种鱼中水溶性蛋白和盐溶性蛋白的收率。2. 根据每个蛋白提取液的总蛋白含量,比较不同鱼类肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。3. 根据电泳结果,分析淡水鱼和淡水鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。4. 根据 Western b
12、lotting 鉴定结果,分析鱼类 MBSP 在鱼肉中的存在形式。6由图可知,盐溶性蛋白含量少且成分较少,在 35KDa 和 45KDa 之间,有两条明显的条带。而水溶性蛋白含量多且成分复杂,在 35KDa 和 45KDa 之间也有两条与盐溶性蛋白同样大小的蛋白条带。此外,海水鱼和淡水鱼的蛋白条带大致相同,仅在小分子量蛋白处有差异。7由图可知,水溶性蛋白中 44KDa 处的蛋白与 MBSP 抗体发生特异性结合,而盐溶性蛋白无特异性反应。说明仅水溶性蛋白有肌原纤维型丝氨酸激酶。七、七、思考题思考题1鱼肉中,为什么存在水溶性蛋白和盐溶性蛋白?比较二者的生理功能。2在 SDS-PAGE 的样品缓冲液中,SDS、巯基乙醇、溴酚兰各起什么作用?