《实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其Western blotting鉴定（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1实验二实验二 鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其鱼类肌肉蛋白的提取、蛋白含量测定及其 SDS聚聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及其丙烯酰胺凝胶电泳检测及其 Western blotting 鉴定鉴定一、一、实验内容实验内容1利用机械破碎和高速离心分离等手段，从不同种类的鱼肌肉中提取水溶性蛋白和盐溶性蛋白。2采用紫外吸收法测定以上各蛋白提取液中的总蛋白含量。3. 对以上蛋白提取液进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测，并利用凝胶成像系统软件对电泳结果进行分析。4. 将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白进行 Western blotting 鉴定。二、二、实验目的和要求实验目的和要求1了
2、解从动物组织中提取蛋白的原理和实验方法。2熟悉蛋白质含量测定的各种方法和基本原理，并根据实验结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。3掌握 SDS-PAGE 的原理和垂直板型凝胶电泳的操作方法，并根据电泳结果，比较不同种类的鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。4掌握 Western blotting 操作方法。三、三、实验仪器、材料和试剂实验仪器、材料和试剂（一）仪器（一）仪器微量移液枪及枪头、微量离心管（又称 Eppendorf 管） 、50ml 离心管、常用玻璃器皿（见表 1） 、台式天平、组织捣碎机、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、垂直式电泳槽装置、凝胶成像系
3、统。（二）试剂准备（二）试剂准备1Buffer I（2000ml）：20mM Tris-Cl, pH8.0 。22Buffer II（500ml）：Buffer I 含有 0.5M NaCl。四、实验操作四、实验操作（一）动物肌肉蛋白的提取（一）动物肌肉蛋白的提取1称取新鲜的淡水鱼或海水鱼剔除鱼鳞、鱼刺及脂肪取肌肉，用刀切碎，称取 3g 左右，加入 30 ml 左右冰冷的 Bufffer I（鱼肉g：Bufffer Iml=1:10） ，在捣碎机中捣碎成匀浆。2将以上匀浆转入 50ml 离心管中，在 4下，10000g，离心 15min，将上清和沉淀分开。3上清用四层纱布进行过滤除去脂肪，滤液
4、即水溶性蛋白提取液（留样留样（1.5ml） 、量体积、测蛋白含量、量体积、测蛋白含量、SDS 化）化）4在以上沉淀中，加入 30 ml 冰冷的 Bufffer I，重悬沉淀，在 4下，10000g，离心 15min， 取沉淀。5重复操作 4 一次。6在以上沉淀中，加入 30 ml 冰冷的 Buffer II，重悬沉淀，再次用组织捣碎机进行捣碎。7将以上匀浆转入 50ml 离心管中，在 4下，10000g，离心 15min，将上清和沉淀分开。上清即为盐溶性溶性蛋白提取液（留样（留样（1.5ml） 、量体积、测蛋白含量、量体积、测蛋白含量、SDS 化）化）（二）蛋白含量测定（二）蛋白含量测定（紫外
5、吸收法）紫外吸收法）取适量的样品提取液（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液） ，根据蛋白质浓度，用 Buffer I 适当稀释后，用紫外分光光度计分别在 280 nm 和 260 nm波长下读取吸光度，以 Buffer I 为空白调零。结果计算：蛋白质浓度= n （1.45 A2800.74 A260） （mgmL）式中：l.45 和 0.74 为校正值；3A280为蛋白质溶液在 280nm 处的吸光度；A260为蛋白质溶液在 260nm 处的吸光度；n 为稀释倍数。（三）蛋白提取液的（三）蛋白提取液的 SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳分析1 聚丙烯酰胺凝胶的配制（1）分离
6、胶(10%)的配制（10ml）：ddH2O 4.0 ml30%储备胶 3.3 ml1.5M Tris-HCl（pH8.8） 2.5 ml10% SDS 0.1 ml10% AP 0.1 mlTEMED 4 l混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平（凝胶完全聚合需30-60min） 。（2）积层胶的配制（5ml）：ddH2O 3.4 ml30%储备胶 0.83 ml1M Tris-HCl（pH6.8） 0.63 ml10%SDS 0.05 ml10%AP 0.05 mlTEMED 5 l将分离胶上的水倒去,加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间（完全聚合需 15-30mim） 。2样品处理：
7、将样品（以上水溶性蛋白液/盐溶性蛋白液）加入等量的2SDS 上样缓冲液，100加热 5min，离心 12000g1min，取上清作SDS-PAGE 分析，同时将 SDS 分子量蛋白标准品作平行处理。3上样：分别取 10l 处理后的样品加入样品池中，并加入 6l 蛋白标准4品作对照。4电泳：在电泳槽中加入 1电泳缓冲液，连接电源，注意正负极接向。电泳时，刚开始电压控制在 90V，当样品到达分离胶后，可将电压调至180V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止。5染色：将胶从玻璃板中小心取出，用考马斯亮兰染色液染色。6脱色；将胶从染色液中取出,放入脱色液中，脱色至蛋白带清晰。7凝胶摄像和保存：在图像处理系
8、统下将脱色好的凝胶摄像，并利用系统软件分析实验结果，凝胶可保存于双蒸水中或 7%乙酸溶液中。（四）蛋白提取液的（四）蛋白提取液的 Western blotting 鉴定鉴定1. 将以上提取的水溶性蛋白和盐溶性蛋白利用 12%SDS-PAGE 电泳分离。2. 用半干式电转移法将蛋白转至 NC 膜上。1） 将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡 10 min。2） 裁剪与凝胶大小相同的 NC 膜，在电转移缓冲液中平衡 10 min。3） 裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC 膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。4） 按 0.5 mA/cm2膜恒流电转移 30
9、50 min。（3）杂交a.将 NC 膜在 5%脱脂奶封闭液中室温反应 1 hr。b.TBST 漂洗 3 10 minc.转移膜至用 TBST1：100 稀释的一抗工作液（抗 MBSP 多克隆抗体）中，室温反应 1 hr。d.TBST 漂洗 3 10 mine.转移膜至用 TBST1：2000 稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔IgG 二抗工作液中，室温反应 1 hr。f.TBST 漂洗 3 10 min。（4）显色将膜浸泡在 DAB 显色液中，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。（5）拍照和保存结果。附：附：溶液配制溶液配制电转移缓冲液48 mmol/L Tris 39 m
10、mol/L 甘氨酸50.01% SDS20% 甲醇TBST20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.50.15 mol/L NaCl0.05% Tween-20Western blot 封闭液：TBST + 5%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白抗体稀释液：TBST + 1%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白DAB 显色液：二氧基联苯胺，Diaminobenzidine五、注意事项五、注意事项1进行高速离心时，两个对称的离心管的重量一定要相等，离心前一定要进行平衡。2蛋白含量测定时，吸光度值最好在 1.0 之内，否则需对样品进行稀释。3为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的 pH 值要准确，10%AP 在一周内
11、使用。室温较低时，TEMED 的量可加倍。4. 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，可通过皮肤和呼吸道吸收，应注意防护。5. 在进行 Western blotting 鉴定时，蛋白 Marker 要用预染 Marker。6. 在进行 Western blotting 鉴定时，转膜方向要正确：凝胶在阴极，膜在阳极。六、六、 结果分析结果分析1. 分别计算每种鱼中水溶性蛋白和盐溶性蛋白的收率。2. 根据每个蛋白提取液的总蛋白含量，比较不同鱼类肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白含量的差异。3. 根据电泳结果，分析淡水鱼和淡水鱼肌肉中水溶性蛋白和盐溶性蛋白成分的差异。4. 根据 Western b
12、lotting 鉴定结果，分析鱼类 MBSP 在鱼肉中的存在形式。6由图可知，盐溶性蛋白含量少且成分较少，在 35KDa 和 45KDa 之间，有两条明显的条带。而水溶性蛋白含量多且成分复杂，在 35KDa 和 45KDa 之间也有两条与盐溶性蛋白同样大小的蛋白条带。此外，海水鱼和淡水鱼的蛋白条带大致相同，仅在小分子量蛋白处有差异。7由图可知，水溶性蛋白中 44KDa 处的蛋白与 MBSP 抗体发生特异性结合，而盐溶性蛋白无特异性反应。说明仅水溶性蛋白有肌原纤维型丝氨酸激酶。七、七、思考题思考题1鱼肉中，为什么存在水溶性蛋白和盐溶性蛋白？比较二者的生理功能。2在 SDS-PAGE 的样品缓冲液中，SDS、巯基乙醇、溴酚兰各起什么作用？
