研究进展-PVY

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1、1.2 马铃薯 Y 病毒的生物学特性与基因组结构特征 1.2.1 马铃薯 Y 病毒的生物学特性 马铃薯 Y 病毒（Potato virus Y，PVY）是马铃薯 Y 病毒属的典型成员，能侵染茄科、 藜科、豆科、葫芦科等多种植物，是烟草、马铃薯、番茄和辣椒等多种茄科作物病毒病的 主要病原之一，并常与烟草花叶病毒（TMV） 、黄瓜花叶病毒（CMV）混合侵染，严重影 响烟草品质，造成巨大的经济损失。在 Potyvirus 属病毒的分类上，一般广泛接受的是， 1988 年 Shukla 和 Ward 提出的 Potyvirus 属的划分标准，即 CP 的氨基酸序列同源性在 38%-71%之间（平均 5

2、4%）的为不同种的病毒，在 90%-99%之间的为同一个种病毒的不同 株系，大于 99%的为同一株系的不同分离物35。按照这一标准，可以将常见的 PVY 株系 分为 3 个株系：PVY -O 称为普通株系，可以引起马铃薯严重的皱缩或条纹落叶病以及烟 草的系统斑驳症状；PVY-N 称为脉坏死株系，引起绝大多数马铃薯栽培品种叶片无症或很 轻度的斑驳病症，造成烟草严重的系统脉坏死；PVY-C 称为点条纹株系，可以在许多马铃 薯栽培品种上引起 条痕花叶症状等过敏性反应36，在其它一些品种上造成系统性花叶，而在烟草上症状 与 PVY-O 的类似37 。1.2.2 马铃薯 Y 病毒的基因组结构与功能 马铃

3、薯 Y 病毒蛋白是多聚蛋白，PVY 含有大小约 10 kb 的正单链 RNA 基因组。 该基因组仅含一个长的开放阅读框架（ORF） ，进行表达时先翻译成一个大的多聚蛋 白（图 2） ，再通过自身编码的蛋白酶将多聚蛋白加工成成熟的蛋白质来行使各种功 能。马铃薯 Y 病毒病毒编码的多聚蛋白含有以下蛋白：P1 主要功能是在多聚蛋白加工（蛋白酶） 、基因组复制、症状表达等起作用，此外还是序列特异基因沉默的辅助因子；HC-Pro 主要 功能是在基因组扩增、自身互作、系统移动、抑制基因沉默、细胞间及长距离运输、协生 和症状表达、种传等方面起作用；P3 主要影响基因组复制、多聚蛋白加工，此外 P3 还是 R

4、svI 介导的致死性系统过敏反应的激发子38； 6K1 主要功能是与膜结合、参与复制、 PSbMV 中决定无毒性；CI 在细胞间运动、复制（RNA 解旋酶） 、症状产生等方面起作用；6K2 具有膜结合功能、参与复制、系统移动；NIa 蛋白酶，以顺式及反式方式起作用，可 以结合 RNA，是 Rym 介导性的激发子，具有 Dnase 活性39；Nib 可以参与病毒基因组的 扩增；外壳蛋白 CP 参与细胞间长距离运输，蚜虫传播和基因组扩增。此外，PVY 5端非 编码区 VPg 蛋白在 5端的结合过程、病毒粒子的起始装配或 RNA 复制酶的识别信号等 方面起到相关作用。PVY 的终止密码子与 Poly

5、 (A)之间有一段 3端非编码区，可能在负 链 RNA 的复制起始中发挥作用40, 41。 1.2.3 PVY Hc-pro 基因的功能研究HC-Pro 是一个多功能蛋白，参与病毒生活史中的许多过程。Atreya（1993） 、Kle（1994） 等在研究烟草脉斑驳病毒（TVMV）时发现 HC-Pro 蛋白参与病毒自身的复制和症状的表 现42, 43。Klein（1994）发现 HC-Pro 与病毒移动有关，在 TVMV HC-Pro 中插入 4 个氨 基酸导致该病毒不能在植物体内进行系统移动43。Rojas（1997）证明 HC-Pro 可以增加 胞间连丝的体积排阻限度（SEL） ，促进病毒

6、 RNA 在细胞间的移动44，这些研究表明 HC- Pro 参与了马铃薯 Y 病毒属病毒的移动。 HC-Pro 可抑制植物的基因沉默，是一个 RNA 沉默的抑制子。研究发现表达 TEVP1/HC- Pro 基因的转基因植株对 PVX 的侵染特别敏感，反式激活病毒的复制，使 PVX 的积累量 增加，出现 PVX 和 TEV 协同侵染时一样的典型症状，增强其致病性，使病毒的危害加重。 缺少 HC-Pro 锌指结构域的 TEV 突变株与 PVX 一起也可以引起典型的协生症状，而如果 将 PVX 与 HC-Pro 中央区域突变了的 TEV 一起接种，就没有协生作用，从而证明抑制植 物的基因沉默过程中起

7、作用的是 HC-Pro 的中央区域，而不是其氨基端的“锌指结构”45。HC-Pro 决定蚜传特性且一个特定病毒的 HC-Pro 能有效地介导其它某些病毒（但不是所有 病毒）的传播，表明 HC-Pro 的蚜传活性有某种程度的专化性46。此外 Carrington 通过一 系列的实验证明了 HC-Pro 的蛋白酶切活性47。2.2.22.2.2 叶片总叶片总 RNARNA 的提取的提取根据根据 Indirect-ELISAIndirect-ELISA 方法鉴定的结果，选取方法鉴定的结果，选取 ELISAELISA 结果呈阳性的结果呈阳性的样品，按样品，按 TrizolTrizol方法提取总方法提取

8、总 RNARNA。（1 1）器皿和容器的处理：）器皿和容器的处理：所有待用的烧杯、研钵、试剂、离心管、量筒、枪头、试剂瓶等都所有待用的烧杯、研钵、试剂、离心管、量筒、枪头、试剂瓶等都用用 0.10.1 % % DEPCDEPC 水溶液在水溶液在 3737 浸泡浸泡 2424 h h。然后将能用高压灭菌的。然后将能用高压灭菌的试剂、器皿、离心管、枪头等高压灭菌试剂、器皿、离心管、枪头等高压灭菌 3030 minmin，玻璃和陶瓷制品，玻璃和陶瓷制品 120120 干热烘干热烘 10-210-2 h h。（2 2）TrizolTrizol 抽提液提取总抽提液提取总 RNARNA 方法：方法：步骤步

9、骤 1 1：剪取植株叶片，放在液氮中磨成粉末；：剪取植株叶片，放在液氮中磨成粉末；步骤步骤 2 2：将粉末转入离心管中，按：将粉末转入离心管中，按 50-10050-100 mgmg 组织：组织：1 1 mLmL TrizolTrizol 液的比例加入液的比例加入 TrizolTrizol 抽提液；抽提液；步骤步骤 3 3：按住管盖用力摇动使其匀浆，室温下放置：按住管盖用力摇动使其匀浆，室温下放置 5 5 minmin；步骤步骤 4 4：加入：加入 200200 LL 的氯仿，盖紧离心管，按住管盖剧烈摇荡的氯仿，盖紧离心管，按住管盖剧烈摇荡 1515 s s，于室温放置，于室温放置 5 5 m

10、inmin；步骤步骤 5 5：于：于 4 4 ，1200012000 rpmrpm 离心离心 1515 minmin；步骤步骤 6 6：取上清液于一新离心管中，加入：取上清液于一新离心管中，加入 600600 LL 的异丙醇，颠倒的异丙醇，颠倒数次混匀，室温放置数次混匀，室温放置 1010 minmin；步骤步骤 7 7：于：于 4 4 ，1200012000 rpmrpm 离心离心 1010 minmin 弃去上清液；弃去上清液；步骤步骤 8 8：加：加 1 1 mLmL 75%75%乙醇轻洗乙醇轻洗 RNARNA 沉淀；沉淀；步骤步骤 9 9：4 4 ，80008000 rpmrpm 离心

11、离心 5 5 minmin；步骤步骤 1010：去上清，室温或真空干燥：去上清，室温或真空干燥 5-105-10 minmin；步骤步骤 1111：溶解在：溶解在 5050 LL DEPCDEPC 处理的水中，保存于处理的水中，保存于-76-76 ，以待，以待使用。使用。2.2.3 DNase 消化处理 （1）用分光光度计测量所提取的 RNA 的浓度，按照 DNase 的规格计算各个样品需要 加入的体积（各个样品加入的量要一致） ； （2）按照 DNase 给的 10 L 体系，扩大体系至 200 L； （3）加入等体积的酚氯仿抽提一次（酚氯仿，水饱和酚/氯仿=1:1） ，12000 rpm

12、离心 10 min，取上清至离心管； （4）加入等体积的氯仿抽提一次，12000 rpm 离心 10 min； （5）取上清至离心管，加入等体积的异丙醇，混匀后静置 30 min，12000 rpm 离心 10 min，弃上清； （6）用 2.5-3 倍体积无水乙醇轻洗沉淀； （7）用 75 %乙醇轻洗两次，晾干，溶于 20-30 LDEPC 水（75 %乙醇用 DEPC 水来稀 释） ； （8）用分光光度计测量所纯化的 RNA 的浓度，用于做 RT-PCR。2.2.42.2.4 cDNAcDNA 的合成的合成用用 TIANScriptTIANScript RTRT KitKit TIANSc

13、riptTIANScript 的反转录试剂盒在的反转录试剂盒在 M-MuLVM-MuLV 逆逆转录酶作用下合转录酶作用下合成成 cDNAcDNA 第一链。冰上操作（使用第一链。冰上操作（使用 DEPCDEPC 水处理过的水处理过的 EppendorfEppendorf 管）管）：（1 1）在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：）在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：1-51-5 gg 总总 RNARNA 或或 50-50050-500 ngng mRNAmRNA；2 2 LL oligooligo (dT)15(dT)15 或或 2 2 LL RandomRandom；2 2

14、LL dNTPdNTP (2.5(2.5 mMmM each)each)；补补 RNase-freeRNase-free dddd H2OH2O 定容至定容至 13.513.5 LL；（注：加入的各个样品的（注：加入的各个样品的 RNARNA 的量要一致，通过浓度来计算的）的量要一致，通过浓度来计算的）（2 2）7070 加热加热 5 5 minmin 后迅速在冰上冷却后迅速在冰上冷却 2 2 minmin。简短离心收集反。简短离心收集反应液后加入以下各组分：应液后加入以下各组分：4 4 LL 5First-Strand5First-Strand BufferBuffer；1 1 LL 0.1

15、0.1 M M DTTDTT；0.50.5 LL RnasinRnasin；（3 3）加）加 1 1 LL (200U)(200U) TIANScriptTIANScript M-MLVM-MLV，轻轻用移液器混匀，如，轻轻用移液器混匀，如果用随机引物，请将离心管置果用随机引物，请将离心管置 2525 温浴温浴 1010 minmin；（4 4）4242 温浴温浴 5050 minmin；（5 5）9595 加热加热 5 5 minmin 终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；终止反应，置冰上进行后续实验或冷冻保存；如果需要用如果需要用 RNaseRNase H H 处理，进行步骤处理，进行步骤 6 6。否则，进行步骤。否则，进行步骤 7 7；（6 6）加）加 RNaseRNase H H 1 1 LL (2(2 U)U)，3737 温浴温浴 2020 minmin 以降解以降解 RNARNA，然后然后 9595 加热加热 5 5 minmin 使酶失活；使酶失活；（7 7）用）用 RNase-freeRNase-free ddH2OddH2O 将反应体系稀释到将反应体系稀释到