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1、第二章 腐烂病菌从剪口侵染的时期、所需条件及在木质部 内生长扩展研究2.1 材料与方法2.1.1 病原菌及孢子悬浮液的制备野生菌株：2009 年 8 月采集苹果树腐烂病病枝，切取病健交界处的病组织转入 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）中，分离获得腐烂病菌(Valsa mali)。用直径 0.8mm 的毛细管，自菌落边缘打取菌丝的端部转入 PDA 中，获得单菌丝分离菌 株。转化菌株：采用农杆菌介导转化法(ATMT)将携带潮霉素 B 磷酸转移酶基因(hph)和 绿色荧光蛋白表达基因(gfp)转入腐烂病菌，获得转化菌株65。经离体和活体测定，转化菌株和野生菌株的生物学性状、致病性、以及在苹 果枝干上
2、形成的症状都没有差异，与田间自然发病情况一致55。2 个菌株都保 存于 4C 的冰箱中。接种前，将保存菌种从冰箱中取出，接种于 PDA 培养基中，25C 下黑暗培 养 35 天，取菌落边缘直径 5mm 新鲜菌饼，接种于大麦粒培养基（浸泡大麦粒 70g,蛋白胨 1g,蜂蜜水 6%，灭菌 2h），25C 恒温箱中培养 15 天，大麦粒上可 产生大量分生孢子器。取产生分生孢子器的大麦粒，转入含有 1%水琼脂直径为 9cm 培养皿中，25C 下保湿培养 3 天，分生孢子器中溢出大量橘黄色分生孢子 角19。用灭菌牙签挑取新鲜孢子角置于纯净水中配置成 106个/ml 的孢子悬浮液， 备用。2.1.2 腐烂
3、病菌从剪口木质部侵染后的扩展动态3 月下旬在青岛农业大学胶州示范园选取 3 年生富士苹果的 12 年生枝条， 距基部 20cm 处剪除枝条形成剪口，剪枝当天接种。用灭菌牙签挑取腐烂病菌 转化菌株新鲜孢子角涂于木质部中央而不接触韧皮部，用湿脱脂棉包裹，塑料 膜包扎保湿，7 天后揭除包扎膜，并标记。接种后每个月剪取 6 个接种剪口枝条，自接种端开始以 0.5cm 为单位，截 切成数个茎段，然后以髓部为中心按十字交叉法，将每个茎段平均分成 4 块枝 条组织，用 75%的酒精进行表面消毒 2min 后转移至无菌水中冲洗三次，最后 将组织块转移至含有 50g/mL 潮霉素的 PDA 培养基中，置于 25
4、恒温箱内进 行培养。检查记录长出腐烂病菌组织块的数量，并在荧光显微镜下观察是否为 接种病菌，以此推断腐烂病菌在苹果枝条木质部内的扩展速度。2.1.3 剪口龄期对腐烂病菌从剪锯口侵染的影响2013 年 3 月 24 日，在青岛农业大学胶州科技示范园 3 年生的富士苹果树 上，随机选取直径大于 0.8cm 的枝条 200 枝，离基部 20cm 处剪除枝条，形成 剪口，并标记。自 3 月 31 日开始，每隔一个月左右接种 20 个枝条。接种时， 用灭菌牙签挑取大麦粒上产生的分生孢子角(LXS080901-16 菌株)置于剪口木质部中央，用湿润脱脂棉球包裹，外部包扎塑料膜，保湿 48 小时。接种后，每
5、隔 一个月检查记录接种枝条的发病情况，当剪口下方枝段出现长径超过 1cm 的典 型腐烂病斑时，记为发病。2.1.4 露温、露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响试验测试了 7 个露温和 7 个露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响。 7 个露温分别为 5C、10C、15C、20C、25C、30C 和 35C，分别由 7 台恒 温箱控制（BluePard MGC-250BP-2, Shanghai Bluepard Instruments Co. Ltd.）。恒温箱 接种前 12 小时开启，并设定相应温度。7 个露时处理分别为接种后保湿 0h、1h、3h、6h、12h、24h 和 48h。全
6、部试验共 49 个露温与露时组合，每个组 合处理 3 个枝条。3 月份苹果萌芽前，自 5 年生的富士苹果树上剪取一年生的健康枝条，用 消毒的枝剪，将枝条截成 20cm 枝段，保持剪口整齐，3 个一组，插入组培瓶内， 加入蒸馏水，使枝条基部浸入水中 2cm，每 3 天更换一次蒸馏水。将水培枝条 转入相应温度的恒温内预处理 12 小时。接种时，从恒温箱中取出枝条，用手持 喷雾器，将腐烂病菌 LXS080901-16 菌株的分生孢子悬浮液均匀喷撒到枝条的 剪口上，直至剪口处有孢子悬浮液流下为止。接种后，除露时处理为 0h 的枝条 不套塑料袋，其他露时处理的枝条，每个组合的枝条套一个塑料袋，然后放回
7、到相应温度的恒温箱中。至处理露时结束，解除套在枝条上的塑料袋，再放回 到恒温箱中继续培养。试验期间，恒温箱内的相对湿度为 50%-80%之间，解袋 后，剪口表面的露水约在 20 分钟内蒸发。接种 72 小时后，将全部枝条取出， 将接种端浸入 75% 的酒精保持 10 秒钟，杀死剪口表面未能侵染的病菌，然后 转入温度 25C、相对湿度为 75%的人工气候箱中再培养 7 天。处理结束将枝条取出，用小刀剥除皮层。然后自接种端开始以 1cm 为单位， 用消毒枝剪（每剪切一次，用 75%的酒精擦拭消毒 20 秒）从每个接种枝条上依 次截取 5 个枝段，然后以髓部为中心按十字交叉法，将每个茎段平均分成 4
8、 块 枝条组织，用 75%的酒精浸泡 2 分钟，,经无菌水漂洗 3 次，转接到 PDA 培养 基中，每皿 4 块，在 25C 下培养。从第 2 天开始，每天检查每块分离组织内 是否有菌丝长出，直到第 10 天结束。若分离组织内有菌丝长出，挑取菌丝在荧 光显微镜下观察，若菌丝内有绿色荧光，则推断该菌丝为接种腐烂病菌的菌丝， 接种病菌已生长扩展至该部分组织内。检查结束，统计每个处理同一深度 12 个 枝段中带菌组织的块数和计算带菌百分率。全部试验在不同时间重复 3 次。每 次重复恒温箱随机分配。2.1.5 温度对腐烂病菌在木质部内生长扩展的影响试验设置 7 个处理温度：5C、10C、15C、20C
9、、25C、30C 和 35C，每 个温度接种 6 个枝条。温度由恒温箱控制，试验前 12 小时开机并设定相应温度。3 月份苹果萌芽前，自 5 年生的富士苹果树上剪取一年生的健康枝条，用 消毒的枝剪，将枝条截成长度为 20cm 枝段，保持剪口整齐。接种时，用手持 喷雾器，将腐烂病菌 LXS080901-16 菌株的分生孢子悬浮液均匀喷洒到剪口上， 直至剪口处有孢子悬浮液流下。接种后，每个组合处理的枝段套一个塑料袋保Comment BL1: 中文中用全角符号湿，然后置于 25C 恒温箱水培。48 小时后，取出接种枝条，6 个一组，转入 7 个不同恒温箱中再培养 7 天。处理结束将枝条取出，,用小刀
10、剥除皮层。然后自接种端开始先以 0.5cm 为 一个单位，用消毒枝剪从每个接种枝条上依次截取 2 个枝段，再以 1cm 为单位， 截取 4 个茎段，以髓部为中心按十字交叉法，将每个茎段平均分成 4 块枝条组 织，经表面消毒后转接到 PDA 培养基中分离病菌，并在荧光显微镜下检查，统 计每个处理同一深度 24 个枝段中带菌组织的块数和计算带菌百分率。全部试验 在不同时间重复 3 次。每次重复恒温箱随机分配。2.2 结果与分析2.2.1 剪口木质部内腐烂病菌的扩展动态由田间实验组织分离结果表明（图 2.1），腐烂病菌可以侵染剪口木质部， 且能在木质部内生长扩展。腐烂病菌侵染木质部后，在木质部内生长
11、扩展的深 度是不断增加的，但每月扩展速度存在差异。 4、5 月腐烂病菌丝在木质部内 的扩展较快，每月接种枝条平均扩展深度分别为 0.5cm, 0.67cm；6 月份菌丝扩 展最快，为 1.46cm；8 月之后菌丝的扩展速度明显变慢，每个月的扩展速度平 均小于 0.3cm。自 12 月份后不再检测，直到次年 6 月份调查发现，在 6 个接种 枝条中，菌丝扩展到达的最远距离为 21cm。The date of detection (month)4月5月6月7月8月9月10月11月Lesion expansion depth (cm)012345图 2.1 剪口木质部内腐烂病菌扩展到达的距离 Fig
12、.2.1 The arrived distance of Valsa mali in pruning wounds xylem extended 2.2.2 剪口龄期对木质部接种腐烂病菌分生孢子后生长扩展的影响自 3 月 24 日剪枝，7 天后即 3 月 31 日第一次接种到 11 月 4 日最后一次 接种，每月接种一次共计 8 次。用腐烂病的分生孢子接种富士苹果枝条剪口木 质部，当年都没有发病，而从第二年的 3 月份开始陆续表现症状。3 月到 4 月 接种枝段的发病数量最多，到 4 月下旬，8 次接种 160 个枝段中，29 个枝段发 病，占总接种剪口的 18.1%；5 月份以后接种枝段的发
13、病数量明显减少，从 5月到 7 月上旬，只有 4 个新增枝段发病，占接种枝条的 2.5%；7 月之后到九月 上旬，接种枝段的发病数量有小幅增加，发病数量增加 10 个，总体发病数量 达到 43 个(图 2.2)。051015202530354045502013.4.272013.6.222013.8.252013.10.72014.3.162014.4.192014.7.6发病剪口数量(个)检测时间(yy/mm/dd)图 2.2 剪口龄期对木质部接种腐烂病菌分生孢子后发病的影响Fig.2.2The effect of pruning wounds age on xylem disease af
14、ter inoculated with conidia of Valsa mali在所有接种剪口枝条中，3、4、5 月份接种的枝段发病率较高，分别为 40%、45%、45%，枯死数量也较多；其次是 8 月份，接种枝段发病率为 30%； 7 月份接种枝段的发病率较低，只有 10%；11 月份接种的枝段发病率最低，仅 为 5%(表 2-1)。表 2-1 苹果腐烂病菌分生孢子在富士苹果枝条剪口龄期上的发病率Table 2-1 Percentage of diseased pruning wounds of ages on Fuji apple branchs inoculated with coni
15、dia of Valsa mali接种日期 The date of inoculation 20 个剪口中发病 剪口数/个 The number of diseased wounds in the 20 pruning wounds 枯死数（个） Dead and drying branches 发病率（%） Percentage of diseased wounds 2013/3/31 8 2 40 2013/4/27 9 6 45 2013/5/25 9 3 45 2013/6/22 3 0 15 2013/7/27 2 0 10 2013/8/25 6 1 30 2013/9/23 5
16、0 25 2013/11/4 1 0 5 2.2.3 露温、露时对腐烂病菌分生孢子自剪锯口侵染的影响腐烂病菌的分生孢子在 5C、10C、15C、20C、25C、30C 和 35C 下均能通过剪锯口侵入苹果枝条的木质部，但不同温度下，分生孢子的侵染数 量和侵入菌丝在木质部内扩展的距离有所差异。在距接种点 3cm 处的枝段上， 除 35C 之外，其他 6 个温度下接种的枝段上都能分离出腐烂病菌(表 2-2)。其 中，20C 下病菌的分离率最高，7 个露时共处理 63 个枝条，切取 252 块木质部 组织，从其中 74 块组织中分离获得接种的腐烂病菌，分离率为 29.4%，与 15 C、25C 和 30C 接种的枝条没有显著差异，但与 5C 和 10C 下接种枝条上病 菌的分离率存在显著差异。35C 下接种枝条上，3cm 处虽没有分离到接种的腐 烂病菌，但 1cm 处能分离到接种病菌，说明 35C 下腐烂病菌的分生孢子也能 从剪锯口侵入木质部。表 2-2 不
