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1、快速微生物检测方法的展望快速微生物检测方法的展望近年来，我们一直致力于探索微生物的快速检测方法（RMMs，下同），并且从验证、法规以及技术和质量的好等方面，同现有的传统方式做对比。结果是很明显的，RMMs 在未来将极大的影响制药及生物技术产业。曾在第五届 PDA 全球年会上，最终用户、监管机构、制药领域专家齐聚一堂。Ed Tidswell 博士曾对无法培养出的菌种（Viable but culturalbe，VBNC）的影响进行了讨论。他提出，在将近 150 万种不同的微生物种群中，只有不到 0.1%的微生物可以通过培养的方式获得。他指出培养基罐装、环境监控和成品的无菌检测并不能检测出所有的微
2、生物。因此，他建议，应该采用快速的，不依赖于培养方式的微生物检测方法新技术的方法学验证和实施新技术的方法学验证和实施在会议上，来自各大企业的技术专家分别阐述了自己的观点。来自诺华制药的 Jennifer Gray 展示了他们使用 MilliporeMilliflex Rapid 替代传统方式进行无菌检测，其原理是 ATP 生物荧光法。他们运用这个方式的动机是为了尽早地发现产品的染菌风险、降低产品放行周期并且也意在提高公司在快速微生物检测方面的专业性。诺华花了 5 天时间验证了 22 个菌种，7 个来自 ATCC，15 个来自环境取样。FDA 批准了对比试验的方案，EMA 在 2010 年 2
3、月份，MHRA 在 2010 年 5 月份也都批准了他们的方案。来自辉瑞制药的 Amelia Tait Kamradt, 讨论了他们使用 PALL 公司 New GeneDisc System 的情况。他们在一些方面做了很多的研究，比如专属性、检查限、耐用性等。来自默克的 Geert Verdonk 博士分享了他使用 Charles River 实验室公司的endosafe 进行的验证工作。他在默克快速微生物检测项目中使用该公司的便携式内毒素产品，并进行了很多验证实验。来自 Accugenix 公司的 Sara Polson 提出他们使用的飞行时间-次级离子质谱分析法（TOF MS）微生物识别
4、系统，可以电离微生物细胞，从而可以把微粒按照尺寸和电荷分开。这种特异性可以用于对微生物种类的识别。其实类似的应用很多，而在国际知名企业中尤为显著，这主要基于这些公司对技术变革的渴望，尤其是对新技术将给他们的生产和产品带来的收益。制药行业是一个即保守又激进的行业。它的保守在于，任何改变都是会付出代价的，尤其是跟人类息息相关的健康挂钩，任何没有原则或者不慎重的改变往往会导致灾难。同时他又是激进的，因为它出来科技发展的前沿，沐浴在科技日新月异进步，各种技术壁垒不断被攻克的氛围之中，创新和开发是这个行业的灵魂之一。各国药典委员会对 RMMs 提出的愿景美国药典委员会专家 James Aker 博士指出
5、，所有美国药典上所罗列的参考方式都适用于几乎所有类型的产品。而且新的方法想要收录到药典中的话，必须不能具有专利保护且来源单一，还要清晰的区分是用于放行标准还是过程检测。因此，如果有企业想要提交一种新型的快速检测方式，并且意在将其收录在药典中的话，必须要考虑到上述的这些面。USP1223 撰写的目的就是为了给企业提供关于替代检测方法的验证指南，而 RMMs 也应该算作是微生物检测的替代方法。事实上，USP62 早已明确了 RMMs 和替代方法可以使用，只要经过合理的验证。欧盟药典委员会的 Han van Doorne 博士指出，欧盟药典的相应章节也规定，只要证明替代方式和现有方式的等效性，那么前
6、者是可以使用的。章节 2.6.27 写道，自动化系统通常被应用于细胞类制品，例如对于无菌水平的日常监控。章节 2.6.7 提到，使用核酸技术来检测支原体。这些都是已经被收入到药典中的新的检测手段。章节 5.1.6 则推出了对于可替代微生物检测方法的验证。之后Han van Doorne 博士提出今后会对章节 5.1.6 进行修订，他们打算增加更多关于过程分析技术（PAT）的内容，用以明确的区分检测、分离、辨别之间的不同。不过，这将不会出现在之后修正版本中，而是以白皮书的形式出现在欧盟药典里，这个章节将会加入基于 DNA 技术的方法。最后他分析了来自于工业用户的调查结果，这个调查来自于制药用户对
7、之后的修订章节的期望，这些期望包括了，什么样的应用已经批准可以使用 RMMs，是否只能将 RMMs 用于实验而非放行，能否披露更多验证方面等诸多内容。日本药典委员会的 Tsuguo Sasaki 博士表示，目前已经有 2 个新的关于 RMMs 章节收录到日本药典中。其中包括章节 22（基于分子生物学的方法来快速鉴别微生物），章节 33（基于荧光染色方法对细胞进行快速计数）。之后他又列举了一些例子，说的是 RMMs 验证与药典要求不在同一层面。例如，有一家滴眼液企业提交了一份快速检测验证方案，使用 ATP 生物发光技术缩短无菌检测时间，从 2 周缩短到 1 周，他们是用大豆酪蛋白培养基来代替之前
8、的培养基，之前的培养基可以修复更多受损细胞。基于这个原因，这个申请没有被批准，Sasaki博士之后又展示了相关数据，一些菌落可以在 R2A 培养基上生长，而 TSA 培养基则不行。因此，这家公司应该重新去研究并且选择更合适的培养基。各国监管部门提供对验证和应用的指导和期望各国监管部门提供对验证和应用的指导和期望澳大利亚药品管理局的 Vivian Christ 提出，他们先后修订了关于 RMMs 的相关条款，澳洲相关法规与欧盟和英国药典上的相关规定大致相同，他们同时还参照了 USP1223，Ph Eur 5.1.6 和 PDA 33 号技术报告以及 ISO17025（对于非标方法的验证）。从立法
9、的角度来看，他们还转向了 GMP 法规，也就是说，接受其他的方法的一个条件是要符合 GMP 的规定，例如附录 11（计算机验证）和附录 15（IQ、OQ、PQ）。然而不同于其他监管机构，澳洲管理局只是默认了新的技术，而没有公开出台相应的声明和政策。FDA 的 David Hussong 博士说 RMMs 技术正是因为顺应了质量源于设计（QbD）的理念而显得非常重要。他们鼓励使用新的技术并且会推进相关的立法进程。对于 QbD，对于生产过程中的分析是需要的，应该持续进行改进，从而检验设计环节是否合理并且对比工艺过程中的改进进行分析。Rajesh Gupta 博士讨论了 RMMs 被用于作为替代的微
10、生物检测方式，从企业的角度来看，这可以针对过程中出现的问题提供更快的解决方案，一些生物制品的有效期很短（有的甚至只有 14 天，这几乎是整个无菌检测的时间）而且产量也很少，一般用于紧急使用，对于这类产品，其意义就尤为重要。所以考虑 RMMs 的时候也要考虑不用产品的不同情况。最后，Tsuguo Sasaki 博士提供了一些在日本 RMMs 使用的看法。日本监管部门将和企业合作去发展 RMMs 在日本的政策。在大多数情况下，受损微生物是无法检测的，如纯化水系统。因此，快速连续监测技术在制药用水环节是非常需要的，除去技术之外，日本将会采用与美国相类似的 RMM 验证提交模式。总结总结正如大家所看到的那样，对于 RMMs 的关注，从最终用户到监管机构都已经到达了非常高的水平，实际的发展势头也很猛。我们无需始终沉浸在 19 世纪技术的影响中。现在是提出变革和创新的时候，所以大家应该致力于对 RMMs 和新方法的探索和研究，以让我们的检测手段与目前飞速发展的工业进程相一致。
