ELISA 知识简介

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1、13.2.3 结合物的制备结合物的制备 酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。 （1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法 进行标记。交联方法一步法、两步法两种。它具有操作简便、有效（结合率达 60%-70%）和重复性好等优点。缺点是 交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可 能交联，影响效果。 （2）过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过

2、碘酸钠将 HRP 分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成 chiff 氏碱而结合。此法简便有效按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响 ELISA 中 最后的酶活性测定。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗 体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子 化合物的方法均可应用。 结合物制得后，在用作 ELISA 试剂前尚需确定其适当的工作浓度。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时， 能维护一个低的本底，并获得测定的最佳

3、灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。在用于具体的 ELISA 检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度 和时间等的影响， 3.2.4 结合物的保存结合物的保存 酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰 箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘 油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。 早期的 ELISA 试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现 在

4、较先进的 ELISA 试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在 4-8保存期可达 6 个月。 由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP 结合 物加硫柳泵，AP 结合物可加叠氮钠） ，以防止细菌生长。 3.2.5 结合物的稀释液结合物的稀释液 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓 度的无关蛋白质（例如 1%牛血清白蛋白） ，通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表 面的非离子型表面活性剂，如吐温 20，0.05%的浓度较为适宜。在

5、间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也 可应用这种稀释液。 3.3 酶的底物酶的底物 3.3.1 HRP 的底物的底物 HRP 催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为 H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2 为供氧体，H2O2 为受氢体。在 ELISA 中，DH2 一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以 便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB) 和 ABTS 2,2-azino-di-(3-ethylbenziaz

6、obine sulfonate-6)。 OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在 492nm 处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是 HRP 结合物 最常用的底物。 TMB 经 HRP 作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB 性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与 H2O2 溶液混和即成 应用液，可直接作底物使用。另外，TMB 又有无致癌性等优点，因此在 ELISA 中应用日趋广泛。酶反应用 HCL 或 H2SO4 终止后，TMB 产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为 405nm。 ABTS 虽不如 OPD 和 TMB 敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 HRP

7、对氢受体的专一性很高，仅作用于 H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。3.3.2 AP 的底物的底物 AP 为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm 波长处有吸收峰。用 NaOH 终止酶反应后，黄色可稳定一时间。2AP 也有发荧光底物（磷酸 4-甲基伞酮） ，可用于 ELISA 作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。 3.4 洗涤液洗涤液在板式 ELISA 中，常用的稀释液为含 0.05%吐温 20 磷酸缓冲盐水。 3.5 酶反应终止液酶反应终止液 常

8、用的 HRP 反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式 ELISA 中一般采用 2mol/L。 3.6 阳性对照品和阴性对照品阳性对照品和阴性对照品 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照， 因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也 为人血清，因为正常人血清在各种 ELISA 模式中可产生不同程度的本底。 阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如 HBsAg 检测的阴性对照品中不可含 HBsAg，最好

9、抗 HBs 也是 阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。 加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗 略的估计。 3.7 参考标准品参考标准品 定量测定的 ELISA 试剂盒（例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可 检测范围的 4-5 个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中. 4. ELISA 的操作要点的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证 ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因固相载体

10、的形 成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。 下文将叙述板式 ELISA 各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 4.1 标本的采取和保存标本的采取和保存 可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液（如血清） 、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测 定其中某种抗体或抗原成份。 有些标本可直接进行测定（如血清、尿液） ，有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物） 。大部分 ELISA 检测均以血 清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清 标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。 除特

11、殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在 ELISA 中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法 采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血 标本可能会增加非特异性显色。 4.2 试剂的准备试剂的准备 按要求准备实验中需用的试剂。ELISA 中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的 缓冲液应用 pH 计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部 分应及时放回冰箱保存。 4.3 加样加样 在 ELISA 中一般有 3 次加样步聚，即加标本，加酶结

12、合物，加底物。加样时应将所加物加在 LEISA 板孔的底部，避 免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 4.4 保温保温 在 ELISA 中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间， 这一保温过程称为温育(incubation)。 ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其 中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐 步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这

13、就是 为什么 ELISA 反应总是需要一定时间的温育。 温育常采用的温度有 43、37、室温和 4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗 体结合的合适温度。 保温的方式除有的 ELISA 仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴。 若用保温箱，ELISA 板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将 ELISA3板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿 盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。 室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指

14、 20-25，但具体操作时可根据说明 书的要求控制温育。室温温育时，ELISA 板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。 为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。 4.5 洗涤洗涤 洗涤在 ELISA 过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。 ELSIA 就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体 结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的， 而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在 ELISA 操作中，洗涤是

15、最主要的关键技术。 洗涤的方式除某些 ELISA 仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种： （1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液仅为蒸馏水甚至可用自来水。洗涤时附接一特殊 装置，使小珠在流水冲击下不断地滚动淋洗，持续冲洗 2 分钟后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡 2 分钟，吸干 即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲洗式则好比淋浴，其洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明， 流水冲洗式同样也适用于微量滴定板的洗涤。洗涤时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔表面，洗 涤效果更佳。 （2）（2）浸泡式 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤

16、剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体 与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基 团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回 复到水溶液状态，从而脱离固相载体。 过程如下： a.吸干或甩干孔内反应液； b.用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去） ； c.浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置 1-2 分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短； d.吸干孔内液体。吸干应彻底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干； e.重复操作 c 和 d，洗涤 3-4 次（或按说明规定） 。在间接法中如本底较高，可增加洗涤次数或延长浸泡时间。 微量滴定板多采用浸泡式洗涤法。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水 性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白 质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回