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1、1人宫颈癌组织及癌旁正常组织蛋白质组 的比较研究【摘要】 目的: 构建人宫颈癌组织及癌旁组织双向凝胶电泳图谱，筛选差异表达的蛋白质. 方法: 人宫颈癌组织及癌旁正常组织标本 10 例，应用固相 pH 梯度双向凝胶电泳后，ImageScanner 扫描图像、ImageMaster 2 DE Elite4.01 软件分析识别差异表达的蛋白质；应用质谱仪得到相应的肽质指纹图谱，联网 ExPASY 网站查询相关数据库鉴定获得的差异蛋白质点. 结果: 癌组织和癌旁正常组织凝胶的平均蛋白质点数分别为 128585 和 106376，凝胶上蛋白质点位置上有较好的重复性，不同胶间蛋白质点在等电聚焦方向的偏差是
2、（1.780.18） mm，在 SDS PAGE方向上的偏差为（1.890.21） mm；比较 10 例宫颈癌组织及癌旁正常组织的双向凝胶电泳图谱，未匹配总点数为 15618，对 31 个差异蛋白质点进行肽质指纹图分析，初步鉴定了 8 个与肿瘤基因、细胞周期调控、信号转导等有关的蛋白质. 结论: 建立了分辨率高且重复性较好的人宫颈癌组织与癌旁正常组织的双向凝胶电泳图谱，并成功鉴定出部分与宫颈癌癌变相关的差异表达的蛋白质，为筛选宫颈癌特异性的诊断分子标志物奠定了的基础. 【关键词】 宫颈癌 双向凝胶电泳 基质辅助激光解析电离质谱 蛋白质组 0 引言 宫颈癌（uterine cervical ca
3、ncer）是妇科常见的恶性肿瘤之一，在非洲和东南亚国家发病率较高. 在我国妇女的各种恶性肿瘤中，子宫颈癌的死亡发生率仅次于乳腺癌1. 我们应用固相 pH 梯度双向凝胶电泳技术分离人宫颈癌组织及癌旁正常组织的总蛋白质，建立双向凝胶电泳图谱，再利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI TOF MS）及数据库搜索对部分差异表达的蛋白质点进行鉴2定，为进一步研究差异蛋白质，揭示人宫颈癌发病机制及其诊断、治疗和新药开发等提供理论基础. 1 材料和方法 1.1 材料 人宫颈癌组织及配对癌旁正常组织（癌周 2 cm） 10 例取自海南医学院附属医院、海南省人民医院、海南省妇幼保健院的宫颈癌手术切除标
4、本，并经病理检查确诊. 所有标本用生理盐水反复清洗去除血液，并尽可能剪去多余的组织. 处理后的样品用于蛋白质的抽提，或置于-80保存待检. 1.2 方法 1.2.1 双向凝胶电泳称取 50 mg 组织样品于液氮下充分研磨至粉末状，用 500 L 裂解液充分涡旋混匀，置于 37孵育 1 h，取出后再充分涡旋混匀，4离心 30 min，吸取上清，应用三氯醋酸沉淀法将其沉淀以去除多糖. 蛋白质纯化后，用Bradford 法测定蛋白质的浓度. 等电聚焦按 IPGphor 等电聚焦系统指南进行. 先定量样品蛋白质和上样，水化和等电聚焦， IPGS 平衡，SDS PAGE，参数设置，在 20下自动进行，总
5、电压时间积为 61480 Vh，SDS PAGE 按 2.5 W/胶条电泳30 min 后改为 10 W/胶条，直到溴酚蓝到达胶的底线. 等电聚焦结束后，将胶条进行两步平衡，然后将平衡后的胶条移至 0. 75 mm 厚的 12.5 g/L 均匀分离胶的上端，进行 SDS PAGE 电泳. 根据蛋白质银染试剂盒的操作手册及文献对 2 DE 胶进行银染. 凝胶可视化：固定、敏化、银染、显影、终止显影、保存液保存凝胶. 用ImageScanner 光密度扫描仪描仪扫描凝胶蛋白质后用获取图像，利用ImageMaster 2D Elite 4.01 分析软件对图像进行强度校正、点检测、背景消减、匹配、1
6、D 校正、建立平均凝胶等分析. 1.2.2 质谱分析及蛋白质鉴定随机选取差异较明显的蛋白质点 20 个，另选取在两块胶上认为匹配的点以及空白胶（溴酚蓝线以外的胶）作为对照，置于ProFlexTMMALDI TOF 质谱仪分析. 以基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作3为内部标准校正，对肽质量指纹图谱进行校正，获得了肽质量指纹图. 联网至ExPASY 网站（www.expasy.org/），应用 PeptIdent 软件进行查询上述试验获得蛋白质点的肽质指纹数据. 统计学处理: 数据以 xs 表示，用 SPSS10.0 软件分析结果. 2 结果 2.1 人宫颈癌组织及对应癌旁正常组织的双向凝胶电泳图
7、谱同一标本的总蛋白质选择上样量为 0.5 mg,进行 3 次重复性的检测，发现每次电泳图谱非常相似. Imagescanner 扫描仪扫描获取图像后，通过软件对其进行点分析，结果发现宫颈癌组织蛋白质斑点总数为 128585，癌旁正常组织蛋白质斑点总数为 106376，大部分蛋白质点主要分布在 Mr 为 30 00097 000，等电点 PI46 的区域（图 1A, B）. 任意选取同一癌组织的 3 块胶中相互匹配且分辨清晰的 20 个蛋白质点，选择位置偏于中间的点作为参与的基准点，以参考胶为参考位置，测量出其他两块胶对点在第一向等电聚焦（IEF）及第二向 SDS PAGE 方向上位置的偏差，发
8、现凝胶的蛋白质点在位置上有较好的重复性，不同凝胶间蛋白质点在 IEF 方向上的偏差为（1.780.18） mm，在 SDS PAGE 方向上的偏差为（1.890.21） mm，获取重复性较好的 2 DE 图谱，有利进一步进行蛋白质组差异分析. 2.22 DE 蛋白质图谱蛋白点匹配分析提取蛋白质并进行 2 DE，发现蛋白质银染图谱较相似，建立了平均凝胶图谱，并进行点检测. 当同一蛋白质点的表达量在某一类型组织凝胶上较其他类型组织凝胶明显增强（校正后蛋白质点的表达量相差 3 倍以上），视其为未匹配蛋白质点，经软件分析 2 DE 图谱，结果发现人宫颈癌组织及癌旁正常组织的不匹配的蛋白质点为 1561
9、8. 宫颈癌组织凝胶中有 857 个未匹配蛋白质点，其中 18 为个差异蛋白质点（图 1A 中标号为 118 的4蛋白质点）；癌旁正常组织凝胶中有 719 个未匹配蛋白质点，其中有 13 个差异蛋白质点（图 1B 中标号为 AM 的蛋白质点）. 差异蛋白质点数 1813. 2.3 差异蛋白质点的肽质指纹图分析通过软件分析人宫颈癌组织及癌旁正常组织差异表达的蛋白质，选择差异蛋白质点，经切割、脱色、还原、烷基化、胰蛋白酶酶解、萃取、脱盐后，用 MALDI TOF MS 并以基质峰、酶自动降解片段峰（m/z1993.9772Da）进行校正，测得各自的肽质量指纹图谱（PMF）. 31 个差异蛋白质点获
10、得了 23 张 PMF. 进入 www.expasy.org 界面，应用 PeptIdent 查询软件在设定查询参数条件下将 MALDI TOF MS 测得各自的肽质量指纹图谱搜索SWISS PROT 以及 TrEMBL 数据库，联合搜索结果及 2 DE 图谱上相应点的表观等电点、分子质量、匹配肽段的多少（4 个片段以上）及氨基酸序列覆盖率（15）等进行综合分析. 结果发现人宫颈癌组织凝胶图谱中 18 个表达差异蛋白质点中，得到 12 张 PMF，有 4 个蛋白质点得到了鉴定（表 1），6 个点没有匹配数据库中的任何记录，2 个点需进一步分析鉴定. 癌旁正常组织凝胶图谱中 13 个表达差异蛋白
11、质点中，得到 11 张 PMF，有 4 个蛋白质点得到了鉴定，3 个点需进一步分析鉴定，4 个点没有匹配数据库中的任何记录.表 1 用 PeptIdent 软件在数据库中搜索到有意义的蛋白质点（略） 3 讨论 目前临床诊断宫颈癌主要依据宫颈细胞学涂片检查， 但其早期诊断阳性率较低. 也有应用 SCC AG 作为诊断宫颈癌的血清标记物， 但仍有约 30%50%的宫颈癌患者外周血中 SCC AG 呈阴性. 因此，寻找一种早期诊断宫颈癌的方法极为迫切. 蛋白质组指纹图能够整体定量、动态反应疾病发生过程中蛋白质的种类及其数量峰值变化规律，有助于寻找疾病相关蛋白，成为诊断和判断预后的生物标记及药物治疗的
12、靶点. 近年来，蛋白组指纹图在临床疾病尤其是肿瘤的诊断、5预防及治疗方面迅猛发展. 丹麦的一个研究小组2利用蛋白质组研究技术分析了 150 例膀胱癌患者的组织，发现所有的鳞状细胞瘤的尿液中均能发现一种化学诱剂银屑素，推测其极可能作为这种肿瘤的早期标志物. Sarto 等3在对肾癌的研究中发现有 4 种蛋白质存在于正常组织而在肾癌细胞中缺如，其中分别为辅酶Q 蛋白色素还原酶和线粒体泛醌氧化还原复合物，提示线粒体功能低下可能在肾癌发生过程中起重要作用. 目前关于宫颈癌的蛋白组指纹图方面的研究国内外尚未见报道. 我们应用蛋白质组学技术建立了重复性较好的人癌组织以及配对的正常组织的双向凝胶电泳图谱，比
13、较分析癌组织和正常组织的蛋白质表达谱，并随机选择差异蛋白质点进行了 MALDI TOF MS 分析，建立其肽质量指纹图并对其进行了初步鉴定，获得了 8 个与肿瘤发生、发展相关的蛋白质，如Ras related protein Kab 39, Mdm2, nucleolar phosphoprotein B23, CEA 等. Ras related protein Kab 39 是 Ras 基因蛋白家族成员，参与肿瘤的发生发展，在癌组织中的表达水平显著低于癌旁的正常组织，但其机制和意义有待进一步研究4. Mdm2 在人的多种肿瘤中表达异常，具有转录因子功能，能自发地导致肿瘤发生，通过调节 p5
14、3 的功能，并且能激活 cyclin A 的启动子而调节细胞周期5. Nucleolar phosphoprotein B23 是一个位于细胞核的磷蛋白，其功能目前尚不清楚,有研究6认为可能与细胞周期中中心粒的复制、Rb 蛋白在核仁内的转运、DNA损伤修复等有关. Cytoplasmic dynein heavy chain 具有抗细胞凋亡功能，它能与核因子 B（nuclear factor B，NF B）的抑制蛋白结合而使其失活而使 NF B信号转导通路激活，该通路与细胞增殖、肿瘤的发生发展密切相关7. CEA 属于非器官特异性肿瘤相关抗原，分泌 CEA 的肿瘤大多位于空腔脏器，如胃肠道、呼
15、吸道、泌尿道等. 正常情况下 CEA 经胃肠道代谢，而肿瘤状态时的 CEA 则进入血和淋巴循环，引起血清 CEA 异常增高，使上述各种肿瘤患者的血清 CEA 均有6增高. 有研究表明， CEA 在宫颈癌患者组织中表达较癌旁组织明显升高，提示其与肿瘤的发生发展密切相关8，但其机制目前尚不清楚. 【参考文献】 1姚嘉斐，王彤. 细胞凋亡调节与宫颈癌发生J. 中国肿瘤杂志，2002, 29(1)：49-52. 2Ostergaard M, Rasmussen HH, Nielsen HV, et al. Proteome profiling of bladder squamous cell carc
16、inomas: Identification of markers that define their degree of differentiation J. Cancer Res, 1997, 51(8): 4111-4117. 3Sarto C, Marocchi A, Sanchez JC, et al. Renal cell carcinoma and normal kidney protein expression J.Electrophoresis 1997, 18(3 4): 599-604. 4Pfeifer GP，Yoon II，Liu L，et al. Methylation of the RASSFIA gene in human cancers J. Biol Chem, 2002, 383(6):907-914. 5Leveillard T，Wasylyk B. The PA DM2 C terminal
