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1、1丝氨酸 526 位点在 MEKK3 介导的 IL 1 信 号途径中的作用【摘要】目的：确定 MEKK3 分子中介导 IL1 信号途径的关键性氨基酸.方法：对哺乳动物 MEKK3 活性环 526 位点的丝氨酸进行人工诱变后，用瞬时转染的方法分别将 526A 基因单独及与 TRAF6 基因同时导入 GES1 细胞中；用免疫印迹、NFB 荧光素酶报告基因测定及免疫沉淀实验检测了 526A 突变体的表达水平、对 IL1 及 TRAF6 介导的 NFB 基因的表达及 MEKK3 与 TRAF6 相互作用的影响.结果：通过与野生型 MEKK3 的对比，观察到 526A 不但阻断了 IL1 及TRAF6
2、介导的依赖于 MEKK3 的 NFB 基因的激活，同时阻断了 TRAF6 与MEKK3 的相互作用.结论：526 位点的丝氨酸在 MEKK3 介导的 IL1 信号途径中起关键性的作用，是不可缺少的关键性氨基酸. 【关键词】有丝分裂原激活的蛋白激酶突变体 TRAF6NFB 白细胞介素1 信号传导 0 引言 有丝分裂原激活的蛋白激酶（Mitogenactivatedproteinkinase,MAPK）信号转导途径，对细胞的炎症性反应、生长、分化、繁殖和生存等起重要的调控作用1.MAPK 和 ERK 的上上级激酶 3（MEKK3），是一种丝氨酸/苏氨酸的 MAP3K，已被证明不但是 TNF,IL1
3、 和 LPS 诱导的 NFB 激活的重要调控激酶2-3，而且是 JNKs 的强激活剂4.到目前为止，有关 MEKK3 在 IL1 信号途径中是如何激活的分子机制仍未明了.最新的研究证明位于 MEKK3 激活环 526 位点的丝氨酸残基是 TLR 诱导的先天性免疫和细胞压力反应的关键性磷酸化调控氨基酸残基5.因此，我们选择 526 位点的丝氨酸进行研究，旨在为弄清 MEKK3 在IL1 信号转导途径中激活的分子机制奠定基础. 21 材料和方法 1.1 材料具有血凝素(HA)标记基因的 MEKK3 和具有 Flag 标记基因的 TRAF6 哺乳动物表达载体 HAtaggedSR3MEKK3 和 p
4、cDNA3flagtaggedTRAF6 由美国 Su 教授惠赠；NFB 和 actinRenilla 荧光素酶报告基因由美国Vaillancourt 教授惠赠.限制性内切酶 DpnI、真核细胞转染试剂 Lipofectamine、抗HA 和抗 Flag(M2)mAb、重组人 IL1、双重荧光素酶报告测定试剂盒、HRP 结合的羊抗鼠 IgG 二抗、NC 膜、化学发光底物、X 光片、预染蛋白质标准、DMEM 细胞培养液及胎牛血清分别购自NewEnglandBiolabs,Invitrogen,Sigma,PeproTech,Promega,SantaCruz,AmershamBioscience
5、,KPL,Kodak,Fermentas,Gibco 和四季青公司；Orion 微板化学发光测定仪为Bertholddetectionsystems 产品. 1.2 方法 1.2.1526Ser526Ala 人工突变体的制备 MEKK3 活性环 526 位点的丝氨酸突变为丙氨酸的人工突变体 526A 的制备按美国 Stratagene 公司提供的 QuikChange 定点诱变的方法进行：以 HAtaggedSR3MEKK3 质粒 DNA 作为模板，合成 1 对含诱变位点的互补引物：5cagaccatctgcatggcagggacaggcattc3和5gaatgcctgtccctgccatgc
6、agatggtctg3（划线部分为诱变位点的丙氨酸密码子），用PfuDNA 聚合酶进行快速 PCR 定点诱变.PCR 条件：9530s 后，按 9530s，551min 和 6812min 顺序，共 25 循环.诱变产物经 DpnI 在 37作用 1h，酶切除去野生型的模板 DNA 后，直接转化入 E.coliXL1Blue 感受态细胞，获得的人工突变体 526A 质粒 DNA 送公司测序鉴定. 1.2.2 细胞培养和瞬时转染或共转染实验在 37含有 50mL/L 的 CO2 的培养箱中，用含 100mL/L 的胎牛血清的 DMEM 细胞培养液培养人胃黏膜 GES1 细胞.在瞬时转染前 24h
7、，对 GES1 细胞进行定量培养，用 Lipofectamine 按制造商提供的3方法及用量，将质粒 DNA 转染入 GES1 细胞中，并设不含质粒 DNA 的对照管.共转染除了必须同时将等量的两种或三种或四种 DNA 在同一试管内混合外，其余方法同上. 1.2.3WesternBlot 测定细胞裂解液的制备方法同免疫沉淀法，测定方法与我们先前报道的一致3，所用的 SDSPAGE 胶浓度为 120mL/L，所用的抗 HA 及抗Flag1 抗的稀释度分别为 11000 及 1500；2 抗的稀释度为 15000，最后用化学发光底物检测膜上的抗原抗体复合物，通过 X 光片显示结果. 1.2.4NF
8、B 荧光素酶报告基因测定分别将 NFB 荧光素酶报告基因与 MEKK3或 526A 进行共转染、或分别将 NFB 报告基因与 MEKK3+TRAF6 或526A+TRAF6 共转染入 GES1 细胞内，同时转染入 GES1 细胞的还有actinrenilla 荧光素酶 DNA 作为转染效率的控制，用双重荧光素酶报告基因测定试剂盒按说明进行相对荧光素酶活性测定.在转染质粒 DNA 后 24h,用终浓度为 10g/L 的 IL1 刺激 GES1 细胞 12h 后，进行 NFB 荧光素酶报告基因测定. 1.2.5 免疫沉淀测定在 GES1 细胞转染 HA 或 Flag 或同时共转染这两种基因标记的不
9、同表达载体 36h 后，用低盐裂解液裂解 GES1 细胞，0.6mL/每孔(6 孔板).每样本取 0.4mL 裂解液与抗体反应 4h 后,加入蛋白 A琼脂糖珠继续反应 1h 以沉淀表达的蛋白抗体复合物.（同时取 20L 的样本进行免疫印迹测定，以验证目的蛋白的表达.）用同样的裂解液洗蛋白 A琼脂糖珠 4 次，最后用 1SDSPAGE上样缓冲液将表达的蛋白抗体复合物自蛋白 A琼脂糖珠上洗脱下来后，加样于 SDSPAGE 胶上，进行与方法 1.2.3 相同的 WesternBlot 测定，以获得结果. 2 结果 2.1526A 人工突变体序列的鉴定及 526A 的表达序列测定表明 MEKK3526
10、 位的碱4基序列已由原来编码丝氨酸的 tca 成功地改变为编码丙氨酸的 gca.在 GES1 细胞转染了 526A 质粒 DNA36h 后，用 WesternBlot 方法检测了 526A 的表达：当用抗HA 抗体与转到 NC 膜上的 526A 表达的蛋白质反应时，可见一条 Mr 约74103 的 526A 特异表达的+HA 标记基因表达的融合蛋白质条带，与理论计算的 MEKK3 活性环 526 位点的丝氨酸突变为丙氨酸的人工突变体 526A 的分子质量相符. 1:未转染时的阴性对照;2:526A;3:转染了野生型 HAMEKK3 的对照. 图 1WesternBlot 测定 526A 人工突
11、变体在 GES1 细胞中的表达 2.2526A 阻断了 TRAF6 介导的依赖于 MEKK3 的 NFB 报告基因的表达当GES1 细胞转染了 TRAF6 或 TRAF6+MEKK3 时，检测到了强的 NFB 报告基因的活性，表明过表达的 MEKK3 增加了 TRAF6 介导的 NFB 荧光素酶报告基因的表达(图 2)；当 GES1 细胞共转染了 TRAF6+526A 基因时，仅检测到较弱的NFB 荧光素酶报告基因的活性，表明 526A 阻断了 TRAF6 介导的 NFB 基因的表达(图 2). 图 2526A 阻断了 TRAF6 介导的依赖于 MEKK3 的 NFB 报告基因的活性 2.35
12、26A 阻断了 IL1 介导的依赖于 MEKK3 的 NFB 报告基因的表达当未转染或转染了野生型的 MEKK3 的 GES1 细胞分别接受 IL1 刺激后，通过荧光素酶报告基因的测定，检测到了强的 NFB 报告基因的活性，表明过表达的MEKK3 增加了 IL1 介导的 NFB 基因的表达（图 3A）；当 GES1 细胞转染了 526A 后再接受 IL1 的刺激，仅检测到了较弱的 NFB 荧光素酶报告基因的活性，说明 526A 阻断了 IL1 介导的 NFB 基因的表达(图 3A)；越多的 526A基因转染入 GES1 细胞中，检测到越低的 NFB 荧光素酶活性(图 3B),表明526A 的阻
13、断作用具有高度特异性. 图 3526A 阻断了 IL1 介导的依赖于5MEKK3 的 NFB 报告基因的活性 2.4526A 使 MEKK3 丧失了与 TRAF6 相互作用的能力结果显示，当 526A 与TRAF6 同时共转染入 GES1 细胞中后，用免疫沉淀法沉淀 526A 后，再用抗Flag 抗体检测沉淀物中的 TRAF6 时，未能检测到 TRAF6(图 4)；接着，用抗 Flag抗体免疫沉淀 TRAF6，用抗 HA 抗体进行 Westernblot 分析，也未能检测到526A(图 4)，说明 526A 不能与 TRAF6 发生相互作用，因此无 526ATRAF6 的复合物存在；而作为对照
14、，HAMEKK3 与 FlagTRAF6 则可发生相互作用形成MEKK3TRAF6 复合物，可被免疫沉淀法所检测(图 5). 图 4HA 标记的 526A 单独、或与 Flag 标记的 TRAF6 表达载体同时转染入GES1 细胞中 3 讨论 许多研究已明确地证明 TRAF6 是 IL1 信号途径中的三种最关键的信号分子之一6-7、NFB 基因的表达是能证明 TRAF6 在 IL1 信号转导途径中发挥作用的最好方式8；同时还证明 MEKK3 在 NFB 和 IL1 信号途径中起重要作用2,5.因此，我们选择 TRAF6 作为本研究的关键成分之一、NFB 报告基因表达的测定作为基本的方法进行 5
15、26 位点的丝氨酸在 MEKK3 介导的 IL1 信号途径中作用的研究. 活性形式的 MEKK3 能引起 TRAF6 介导的 NFB 基因的表达增强，526A 的表达降低了 TRAF6 介导的 NFB 报告基因的表达,证明了丝氨酸 526 在 MEKK3参与的 TRAF6介导的 NFB 基因的表达中起关键性作用. IL1 不但能激活未转染的 GES1 细胞中 NFB 基因的活性（含有内源性的MEKK3,几乎所有的真核细胞自身都能产生），而且能增加转染了活性形式的MEKK3 基因的 GES1 细胞的 NFB 基因的表达，表明过表达的 MEKK3 可增6加 IL1 介导的 NFB 基因的表达；在
16、526A 基因转染入 GES1 细胞中后，当接受 IL1 刺激时，GES1 细胞的 NFB 基因的表达水平降低；而且 526A 基因转染入 GES1 细胞中越多，NFB 基因的表达降低的也越多，说明 526A 阻断IL1 介导的 NFB 基因的激活具有很强的特异性.我们的结果证明了 MEKK3活性环的 526 位点的丝氨酸在 IL1 介导的 NFB 基因活化中起决定性作用. 在本研究中，我们应用高特异性的抗 HA 和抗 Flag 抗体，测定融合蛋白质HAMEKK3 或 HA526A 和 FlagTRAF6,先前的研究已证明这是一种研究蛋白质分子之间相互作用的可靠的方法.通过共转染试验，我们发现野生型
