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1、1CD446 基质金属蛋白酶及其抑制因子 在子宫内膜增殖症中的表达及意义【摘要】 目的 研究子宫内膜增殖症组织中 CD44V6、基质金属蛋白酶 MMP-2、MMP-9 及其抑制物：组织金属蛋白酶抑制剂 TIMP-1、TIMP-2 的表达，探讨它们在子宫内膜不典型增生诊断、治疗中的价值。方法 应用免疫组化二步法对子宫内膜增殖组及对照组的子宫内膜组织中 CD446、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 的表达进行研究、分析。子宫内膜增殖组共 92 例，其中单纯性增生 24例，复杂性增生 26 例，不典型增生 42 例；正常增生期子宫内膜共 23 例。结果 在不同的病理分型中随组织细胞
2、异型性的增加，CD446、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 阳性表达率均增加。对不典型增生组中该五指标的阳性表达进行Spearman 相关性分析，它们的阳性表达强度之间存在正相关。结论 推测它们可能相互作用共同促进细胞过度增殖，从而导致肿瘤的形成和进展。 【关键词】 子宫内膜增殖症 免疫组织化学 CD446 基质金属蛋白酶 组织金属蛋白酶抑制剂【Abstract】 Objective To analyze the expression of CD446, MMP-2,MMP-9 and their inhibitor TIMP-1,TIMP-2 in tissue of en
3、dometrial hyperplasia, then to investigate their clinical value in diagnose and treatment in atypical hyperplasia of endometrium (AH). Methods Immunohistochemistry technique was used to detect CD446, MMP-2, MMP-9, TIMP-1 and TIMP-2 expression in EH group and control group .In EH group ,there were 24
4、 cases of single hyperplasia ,26 cases of complex hyperplasia and and 42 cases of atypical hyperplasia . Results The positive rate of CD446, MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2 were different in various types of EH. The expression of CD446、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 had a striking positive correlation with
5、the heteromorphism in cells and tissue of AH using Spearman correlation analysis . Conclusion CD446、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 might work together play an important role in Endometrial Hyperplasia ,which might be related with tumor 2formation .【key words】 Endometrial Hyperplasia Immunohistochemistry
6、CD44V Matrix metalloproteinase (MMPs) Tissue inhibitors of matrix metalloproteinases(TIMPs)子宫内膜增殖症是指发生在子宫内膜的一组增生性病变。CD446 与肿瘤细胞的成瘤性、侵袭性及转移性密切相关。基质金属蛋白酶（MMPs）可以降解细胞外基质和基底膜，还可以通过促进细胞增殖、新生血管形成，调节凋亡以及细胞粘附，促进肿瘤细胞的发生、浸润和转移。MMP-2、MMP-9 是其中的成员。TIMPs 作为 MMPs 的天然抑制物，可抑制 MMPs 对细胞外基质的降解。作者采用免疫组化二步法，对子宫内膜从正常增生期单
7、纯性增生复杂性增生不典型增生组织中 CD446、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 的表达及相互关系进行研究，探讨各指标在子宫内膜细胞增殖及恶变发生发展中所起的作用。1 材料与方法1.1 一般材料选择自 2001 年 1 月至 2005 年 11 月在温州医学院附一医院就诊病例，随机抽取临床、随诊资料及临床病理资料完整的子宫内膜增殖症患者 92 例，经诊断性刮宫病理科存档子宫内膜组织标本蜡块。该 92 例设为观察组，其中子宫内膜单纯性增生 24 例（第 2 组），复杂性增生 26 例（第 3 组），不典型增生 42 例（第 4 组）。所有病例和标本要求满足以下条件：（1）经 1
8、0%福尔马林溶液固定，组织包埋好；（2）诊断性刮宫前无激素替代治疗，未经放疗或化疗；（3）根据国际妇科病理协会（ISGP）1987 年病理诊断分型标准1，将子宫内膜增殖症患者的子宫内膜组织HE 切片分为单纯性增生、复杂性增生、不典型增生。收集同期在病理科存档的功能失调性子宫出血患者的子宫内膜组织标本蜡块 23 例（均为增生期内膜标本），3设为对照组（第 1 组）。1.2 方法采用免疫组化二步法，CD446、MMP-2、TIMP-2 单克隆抗体及二抗试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司，MMP-9、TIMP-1 单克隆抗体购自上海长岛生物技术有限公司。实验步骤严格按照操作方法说明进行。1.3 结
9、果判定参照 FromowotZ 综合计分法2，进行双盲半定量分析。随机选择 5 个高倍视野，计数内膜细胞总数和阳性细胞数，得出阳性细胞百分率及计分。0 分：无阳性细胞；1 分：阳性细胞 1%25%；2 分：阳性细胞 26%49%；3 分：阳性细胞50%；根据多数细胞的着色强度计算强度得分，0 分：无着色；1 分：浅褐色；2 分：棕褐色；3 分：深棕褐色；阳性率和强度计分相乘后的积分（09）分为 3 组：积分 0 为不表达（-）；积分 13 为低表达（+）；积分 49 为高表达（ ）。1.4 统计学方法本研究实验数据均采用 SPSS 10.0 统计软件处理。计数资料采用 2 检验。相关性分析采用
10、 Spearman 等级相关性分析。以 =0.05 为检验水准，P0.05 为差异有统计学意义。2 结果本研究子宫内膜增殖组入选病例 92 例，均为已婚妇女。发病年龄 3272 岁。治疗情况：单纯性增生及复杂性增生患者给予孕激素周期治疗 6 个月，前者无复发，4后者复发 1 例。不典型增生患者行子宫切除术 28 例;给予孕激素周期治疗 6 个月14 例，停药后再次诊刮，因病变无改善或加重而行子宫切除术 2 例（其中 1 例术后病理诊断为子宫内膜腺癌）。对照组年龄 4056 岁。2.1 CD446 主要定位于子宫内膜腺上皮细胞胞浆，部分细胞胞膜着色。4 组间阳性表达有统计学差异 2=25.771
11、，P0.001，见表 1。2.2 MMP-2 主要定位于子宫内膜腺上皮细胞及部分间质细胞胞浆。在 4 组间阳性表达有统计学差异 2=42.058，P0.001。两两比较，正常增生期组与复杂性增生组*、不典型增生组*有显著性差异，*2=14.547，P0.001；*2=16.242，P0.001。2.3 MMP-9 主要定位于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆，在细胞靠近基底膜的边缘部分显色更深，部分间质细胞胞浆着色。4 组间阳性表达有统计学差异（2=17.649，P=0.001）。 2.4 TIMP-1 主要定位于子宫内膜腺上皮细胞及部分间质细胞胞浆，也有细胞近基底膜的边缘部分显色更深的表现。4 组间阳
12、性表达有统计学差异，2=32.305，P0.001。2.5 TIMP-2 主要定位于子宫内膜腺上皮细胞及部分间质细胞胞浆。阳性表达率有统计学差异 2=38.618，P0.001。表 1 CD446、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2 的表达（略）注：1.正常增生期组；2.单纯性增生组 3.复杂性增生组；4.不典型增生组。2.6 对不典型增生组中该 5 个指标的阳性表达率进行 Spearman 相关性分析，结果：CD44 V6 与 MMP-2、CD446 与 MMP-9、MMP-2 与 MMP-9 阳性表达强度5之间均存在正相关。 （见表 2）表 2 不典型增生组各指标相关性分析
13、（略）3 讨论子宫内膜增殖症是妇女的常见病，可分为三类：单纯性增生，复杂性增生及不典型增生。大多数子宫内膜增生是一种可逆性病变，有些保持一种持续的良性状态，甚至可随月经期内膜的剥脱而自然消退，但也有些可能经增生、不典型增生、最后发展为子宫内膜癌。目前子宫内膜增殖症主要依靠诊断性刮宫确诊。但有统计发现50%患者的宫腔未被完全诊刮，15%的癌变因漏刮而漏诊3。CD44 蛋白是一种细胞表面粘附分子，主要出现在机体的病理过程，特别是肿瘤的发生、发展过程中4。CD446 是变异型中的一种，通常在肿瘤细胞表面异常表达，改变肿瘤细胞表面粘附分子的构成和功能，与肿瘤的发生、发展密切相关5。本研究结果表明：CD
14、446 在子宫内膜复杂性增生，不典型增生中阳性表达率明显高于正常子宫内膜，而且随着子宫内膜腺上皮细胞异常增生程度的增加，CD446 阳性表达强度也随之增加。有人用 RT-PCR 法检测子宫内膜、不典型增生和子宫内膜癌组织中 CD446mRNA 表达，结果显示其表达率和相对含量呈显著性递增的趋势6。这些都提示 CD44 V6 阳性有可能与内膜异常增生及恶变密切相关，异常增生的腺上皮细胞从生化和形态学表现出了肿瘤细胞的特征。CD446 有可能成为早期诊断子宫内膜癌前病变的生物学标记之一。基质金属蛋白酶(MMPs)家族是一组锌离子依赖性蛋白水解酶，几乎能降解细胞外基质(ECM)的所有成分。MMP-2
15、、MMP-9 是降解 ECM 和基底膜主要结构的关键酶，对恶性肿瘤的发展及间质血管生成起着重要作用。Laird 等7认为, MMP-2 及 MMP-9 是子宫内膜中主要基质金属蛋白酶，随着子宫内膜癌的发展，MMP-2、MMP-9 产生明显增加，对基质间质和内皮细胞基底膜的降解也明显增多。本研究应用免疫组化二步法对正常增6生期子宫内膜及单纯性、复杂性、不典型增生子宫内膜细胞中 MMP-2、MMP-9 蛋白表达进行检测。结果显示， MMP-2、MMP-9 阳性率不典型增生组显著高于正常增生期组、单纯性增生期组。随着细胞异型性的增高，表达率递增。在肿瘤的发生、发展过程中，MMPs 的分泌和活化并不是
16、 ECM 降解的唯一条件，因为 MMPs的活性可被一组称为金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的内源性物质所抑制。MMPs与 TIMPs 的平衡是维持 ECM 内环境稳定和完整的决定因素。TIMP-1 对 MMP-9 有较强的特异性抑制作用。TIMP-2 多随 MMP-2 的表达而表达。本研究结果表明，不典型增生组 TIMPs 阳性率显著高于正常增生期组。在肿瘤的发生、发展过程中，MMPs/ TIMPs 平衡被打破，趋向于细胞外基质降解的一边，且失去可调控性。在恶性肿瘤发生机制的癌基因研究中，不少学者提出了多基因协同假设学说，认为在恶性肿瘤发生发展阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的癌基因各自发挥着不同作用，并在时间和空间上相互配合，协同促进细胞的癌变。近年发现 CD44 对 MMPs 的表达和活化也有影响。CD44v 可激发活体细胞内某种信号的传导，使肿瘤细胞分泌 MMPs，加速 ECM 降解。CD44v 可诱导 MMP-2 分
