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1、1四种微量石蜡组织 DNA 提取方法的比较作者：黄幼生，宋伟伟，邓晓佳，罗志飞，解娜【摘要】 目的：探讨从微量福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin fixation and paraffin embedded tissues，FFPET)中提取 DNA 的简单而高效的方法。方法：采用Chelex 100 提取法、酚氯仿抽提法、单纯消化法、水煮法 4 种方法提取组织DNA；应用聚合酶链反应扩增 100500bp 长度 DNA 片段，然后进行电泳分析，1年后重复 PCR 电泳分析。结果：小于 200bp 长度 DNA 片段扩增，Chelex 100 提取法、单纯消化法阳性率分别为 88.8%
2、、78.8%，明显优于酚氯仿抽提法（15.0%）（P0.01）及水煮法（21.3%）（P0.01）。随着扩增长度的增加，PCR 扩增效率逐渐降低，Chelex 100 提取法 PCR 反应总阳性率为 82.5%，单纯消化法为 66.5%，水煮法为 13.4%，酚氯仿抽提法为 13.4%。1 年后重复 PCR 总阳性率分别为80.1%、31.7%、2.5%、9.2%。结论：Chelex 100 提取法方便简单，适用于微量石蜡组织 DNA 扩增分析；单纯消化法及水煮法在一定条件下适用于微量石蜡组织短片段 DNA 的扩增。 【关键词】 石蜡组织;DNA 提取;Chelex 100 提取法ABSTRA
3、CT Objective: To explore the simple and effective method for DNA extraction from microamount formalin fixation and paraffin embedded tissues (FFPET). Methods: The DNA was extracted by four different methods: Chelex 100 extraction, phenol chloroform purification, simple digestion method and water coo
4、king method. The DNA fragment with 100 500 bp length was amplified by PCR. It was analyzed by electrophoresis, and the procedure including PCR and analysis was repeated 1 year later. Results: For amplification of DNA less than 200 bp, the positive rates of Chelex 100 group and simple digestion group
5、 were 88.8% and 78.8%, respectively, which were significantly effective than phenol chloroform purification 2group (15.0%) (P0.01) and water cooking group (21.3%) (P0.01). The amplication efficacy decreased as the length increase. The total positive rates of PCR were 82.5% in Chelex 100 group, 66.5%
6、 in simple digestion group, 13.4% both in water cooking group and phenol chlorform group. And the positive rates in repeated assessment were 80.1%, 31.7%, 2.5% and 9.2%. Conclusions: Chelex 100 extration method is easy and applicable in amplification analysis of DNA extracted from mircoamount paraff
7、in embedded tissues; while simple digestion method and water cooking method are suitable to analysis of short length DNA fragment extracted from mircoamount paraffin embedded tissues.KEY WORDS Paraffin embedded tissue; DNA extraction; Chelex 100 extraction医院病理科存在大量各种疾病甲醛固定石蜡包埋组织（formalin fixed and p
8、araffin embedded tissues， FFPET），为分子病理研究提供了大量的信息来源。然而福尔马林固定后的蜡块包埋组织 DNA 降解严重1，档存 FFPET 组织切取量有限，传统酚氯仿提取 DNA 步骤繁杂，提取过程损失严重等都制约了石蜡组织在分子病理学中的研究应用2。如何高效、高质量提取微量石蜡组织 DNA 对利用石蜡组织进行分子研究至关重要。本实验在前人及前期研究的基础上3，进一步探讨改善石蜡包埋组织 DNA 的提取方法及各种方法在不同条件下的应用。1 材料与方法1.1 材料选用海南医学院附属医院病理科 20062007 年间存档的胃癌、乳腺癌、鼻咽癌、结肠癌石蜡包埋组织各
9、 25 例。所用物品包括 PCR 仪(Biometra)、蛋白酶 K(Merck公司)、Taq DNA 聚合酶(北京华美)、Chelex 100(Bio Rad Iboratory)。1.2 方法黄幼生等.四种微量石蜡组织 DNA 提取方法的比较 1.2.1 提取 DNA 方法 将每例石蜡包埋组织块切片 6m 厚，分装于 4 个 EP 管中，3每管 5 片(鼻咽癌组织 10 片)，切不同病例的蜡块时用二甲苯擦洗刀片 2 遍，以免交叉污染。先统一去蜡：在每管中加入二甲苯 1mL 置于 55恒温摇床中，20min后 12000r/min 离心 10min，去上清，加入新鲜二甲苯重复一次；再用无水乙
10、醇洗涤 2 次以脱去二甲苯，离心后弃上清，在 55恒温箱干燥沉淀。采用 4 种方法提取 DNA：（1）单纯消化法：用 100L 的组织裂解液（0.2%SDS，10mmoL/L TrispH8.0，0.5mmoL/LEDTApH 8.0）悬浮沉淀，加入 5L 蛋白酶 K(20mg/mL)消化，55振摇 8h 或过夜至溶液澄清。98加热 10min 灭活蛋白酶 K，冰上3min，12000r/min 离心取上清（DNA 在上清液中），4储存备用。 （2）Chelex 100提取法：步骤同单纯消化法，提取上清后，在上清液中加入 5%Chelex 100 颗粒，4过夜储存备用。 （3） 酚氯仿抽提法：
11、在 EP 管中加入 200 mL 蛋白酶 K 缓冲液(50 mmol/L Tris HCl pH 8.0，5 mmol/LEDTA pH 8.0，0.2%Tween 20)及 5 L 蛋白酶 K(20mg/mL)，置 55水浴振摇过夜，取出后煮沸 10min，离心，取上清；用等量酚氯仿异戊醇抽提 2 次；加 2.5 倍冰无水乙醇(-20)和 1/10 体积 3mol/L 乙酸钠沉淀 DNA，-20静置 3h；取出后 4下 14000 r/min 离心 15min，弃上清。用 70%乙醇洗涤沉淀 2 次，室温通风干燥沉淀后用 50L TE 液(pH8.0)溶解 DNA，4保存。（4）水煮法：在
12、EP 管中加入 100L 去离子水。室温静置 2h 后 98加热15min，12000r/min 离心 10min 后取上清即为模板 DNA。1.2.2 PCR 扩增 选择 3 对多态性位点引物，由上海生物工程公司(Sangong)合成。引物序列、退火温度及扩增片段长度见表 1。PCR 反应体系为 25L，10PCR 反应缓冲液 2.5L；25mmoL/L MgCl21.5L；10mmoL/L dNTP0.5L；10vmoL/L 引物各1L；模板 2L；5U/L Taq 聚合酶 0.5L，余下由灭菌去离子水补足。经 94变性5min 后进入循环：94变性 30min；退火 45s；72延伸 3
13、0s，完成 35 个循环后于472下延伸 5min。每次 PCR 反应均设阳性、阴性对照。表 1 PCR 扩增所用引物列表引物名称序列长度（bp）退火温度（）D1S3466ATGTCTTTGATCCTATGGAAGG189 20956 TGGGTAACAGACCCTGTCTCSS903GTCAGGGCGTCTTCCCAGTT28560TGAGCCTCGGCATCTACATCTT SS448AGGCGTGTCCTTTCGTTTCT46861 GCCACTCCCACTGCTCAA1.2.3 DNA 鉴定方法 （1）DNA 质量的琼脂糖凝胶电泳鉴定:取 5L DNA 加 1L的 DNA loadin
14、g buffer 混匀上样，在 2%的琼脂糖凝胶中 80V 电泳 30min，在紫外凝胶成像仪下观察所提取 DNA 基因组及 PCR 产物的质量并拍照存档。 （2）DNA纯度量鉴定；各取 5LDNA 样品，加水至 500L 混匀后，转入分光光度计的石英比色杯中，先用 500L 水校正零点，于 260nm 和 280nm 处分别读出吸光度(OD)值，检测 DNA 的 OD 值。2 结果海南医学院学报 Vol.16 No.9 Sep.20104 种方法提取的 DNA 经凝胶电泳分析显示，Chelex 100 提取法、单纯消化法提取的 DNA100%有条带出现，主要集中在 4001000bp；水煮法
15、提取的 DNA46.3%有条带出现，主要集中在 100bp 以下；传统酚氯仿提取的 DNA15%有条带出现，主要集中在 5001500bp 之间。4 种方法提取的 DNA 经分光光度计测定显示5Chelex 100 提取法、酚氯仿抽提法提取的 DNA 纯度无明显差异（P0.05），但优于另外 2 种方法(P0.05)。4 种方法提取的 DNA 量及纯度见表 2。表 2 4 种方法提取的 DNA 平均纯度及产量（n=100）（s）提取方法纯度（260/280）DNA 产量（g/100mg）Chelex 100 提取法 1.730.3352.98.76单纯消化法 1.180.3155.410.41
16、水煮法 1.030.233.10.25酚氯仿抽提法 1.780.291.20.574 种方法提取的 DNA 进行 PCR 扩增，小于 200bp 长度片段扩增，Chelex 100 提取法、单纯消化法阳性率分别为 88.8%、78.8%，明显优于酚氯仿抽提法（15.0%）及水煮法（21.3%）（P 均0.01）。随着扩增长度的增加，PCR 扩增效率逐渐降低，285bpDNA 片段 4 种方法 PCR 扩增效率分别为 86.8%（Chelex 100 提取法）、67.5%（单纯消化法）、13.8%（水煮法）、12.5%（酚氯仿抽提法）(图 1)；485bp 扩增效率分别为 71.3%、52.5%、5%、12.5%。总的 PCR 反应阳性率分别为82.5%、66.5%、13.4%、13.4%。1 年后 4 种方法提取的 DNA 重复 PCR 扩增，小于200bp 片段 PCR 扩增阳性率无明显变化，但大于 200bp 片段扩增
