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1、1半枝莲联合反应停治疗肝癌的实验研究作者：李凌,徐雪明,李春来,程学新,万福生【摘要】 目的 通过 BALB/C 小鼠皮下接种肝癌 H22 细胞建立移植瘤模型,采用半枝莲乙醇提取液瘤内注射联合反应停治疗小鼠肝癌,探讨两药联合对肝癌移植瘤的抑制作用。方法 体外培养小鼠肝癌 H22 细胞,取对数生长期细胞试验。乙醇回流提取半枝莲。接种 H22 细胞于 BALB/C 小鼠皮下建立肝癌 H22 的移植瘤模型。28 只雄性 BALB/C 小鼠随机分为 4 组,每组 7 只。A 组：反应停灌胃；B 组：半枝莲乙醇提取液瘤内注射；C 组：半枝莲乙醇提取液、反应停联合用药；D 组：1%乙醇0.20.5 mL
2、瘤内注射。观察肿瘤大小和瘤重,比较抑瘤效果。移植瘤采用抗 CD31单抗做免疫组化染色,测定移植瘤组织微血管密度(MVD)。结果 A、C 组之间瘤重差异有统计学意义(P0.01),B、C 组之间差异有统计学意义(P0.05)。A、B、C 组抑瘤率分别为 18.11%、53.15% 和 71.65%；协同系数 0.74。3 个治疗对照组之间微血管计数比较差异有统计学意义(P0.01),SNK-q 检验显示 A 组和 B 组之间差异不明显(P0.05),A、B 组分别与 C 组比较差异有统计学意义。结论 半枝莲乙醇提取液瘤内注射联合应用反应停对小鼠 H22 肝癌移植瘤有较强的抑制作用。半枝莲和反应停
3、均有抗血管生成作用,两药联用对肿瘤微血管生成的抑制有协同作用。 【关键词】 半枝莲；反应停；肝肿瘤；抗血管生成；动物模型Abstract：Objective BALB/C mice were inoculated subcutaneously with hepatoma 22 (H22) cells, and the treatment effect of thalidomide and intratumor injection of ethanol extract of Scutellaria Barbata (SB) on tumor growth were evaluated. Meth
4、ods In vitro, mouse H22 liver cells were cultivated, and H22 cells in the logarithmic growth phase were tested. SB was extracted in the ethanol recirculation. A total of 28 BALB/C male mice inoculated subcutaneously with H22 cells were randomly divided into 4 groups, 7 mice per group. Group A：intrag
5、astric administration with thalidomide. Group B：SB 2intratumor injection. Group C：combination of thalidomide and SB with the same administration as Group A and Group B. Group D (control group)：1% Ethanol 0.20.5 mL intratumor injection. Tumor volumes of four groups were observed and the tumors were w
6、eighed. The microvessel densities (MVD) of all transplantation tumors were measured by immunohistochemical staining with anti-CD31 monoclonal antibody. Results There were statistically significant differences between Group C and Group A (P0.01), or Group B (P0.05). The cooperative coefficient was 0.
7、74, meanwhile the inhibititory rates of Group A, B and C were 18.11%, 53.15% and 71.65%, respectively. Measurement of Microvessel Count：There were Statistically significant differences among the treated groups and the control group D (P0.01), no statistically significant differences between group A
8、and B (P0.05). The studies showed statistically differences between Group C and Group A (P0.05), and between Group C and Group B (P0.01), respectively. Conclusions The combinatation of intratumor SB injection and thalidomide elicited significant antitumor activities on the transplanted tumor model o
9、f H22. Anti-angiogenesis effects of SB and thalidomide was found, furthermore, the combination agent showed synergistic action of antiangiogenesis.Key words：Scutellaria Barbata D.Don；thalidomide；hepatoma；antiangiogenesis；annimal model 动物可移植性肿瘤是目前国内外肿瘤实验研究中最常用的一种模型。小鼠移植性肝癌模型 H22 作为对药物进行临床验证的“筛选系统”已证明
10、是有效的1。本实验将半枝莲与反应停联合应用,通过建立 BALB/C 小鼠皮下接种肝癌 H22 细胞建立移植癌模型来探讨其抑瘤效果；采用抗 CD31 单抗做免疫组化染色,测定移植瘤组织微血管密度(MVD),探讨半枝莲和反应停联合用药的抗肿瘤血管生成作用。1 材料与方法1.1 细胞培养H22 细胞株(南京凯基生物科技发展有限公司)培养于含 10%胎牛血清的 RPMI 1640(GIBCO 公司)培养液中,置于 CO2 浓度为 5%、相对湿度为 95%、温度为 37 的细胞培养箱中培养。细胞传代后培养 48、96 h 的贴壁细胞为对数生长期细胞,取传代后 48 h 细胞。31.2 半枝莲乙醇提取液的
11、制备用半枝莲干品 50 g,采用 4 倍量的 70%乙醇加热回流提取 3 次,每次 1 h。120 目网筛过滤弃药渣,用干燥滤器过滤,取滤液 25 mL,用旋转蒸发仪蒸干后,105 干燥 3 h,冷却 30 min,称取干燥品重量,所得重量/25 mL 即为半枝莲乙醇提取液。将剩余滤液调整 pH 值至 7.07.2 后于-20 保存备用。1.3 造模采用 BALB/C 小鼠,5 周龄左右,雄性,体重(172.19)g。记录接种前每只小鼠体重。接种对数生长期 H22 细胞于小鼠右侧腹股沟皮下,接种量约 6.0106/只。28只 BALB/C 小鼠接种后完全随机分为 4 组,每组 7 只。反应停组
12、(A 组)自接种第 1日起,反应停 50 mg/kg 灌胃 D1-12；半枝莲乙醇提取液瘤内注射组(B 组)半枝莲乙醇提取液 1 g/mL 0.20.5 mL 瘤内注射 D6,8, 10,12；联合用药组(C 组)同时采用A 组与 B 组的给药方法；对照组(D 组)自接种第 6 日起,1%乙醇 0.20.5 mL 瘤内注射 D6,8,10,12。自接种第 4 日起每日测量小鼠右侧腹股沟皮下移植瘤大小。瘤体体积/4ab2(a 为长径,b 为短径)。接种第 12 日,小鼠称重后脱颈髓处死荷瘤小鼠,剥离瘤体后称取瘤重。抑瘤率(对照组瘤重给药组瘤重)/对照组瘤重100%；协同系数对照组瘤重联合用药组瘤
13、重/(单药组瘤重单药组瘤重)；当抑瘤率40%,P0.05 判定有抗肿瘤作用；当协同系数1 时为有协同性。1.4 免疫组化测定瘤体血管密度移植瘤采用抗 CD31 单抗做免疫组化染色,测定移植瘤组织 MVD。参照文献2方法,在低倍镜下选取 5 个 MVD 最高的区域,1025 倍放大的视野下,每一个着染4的单个内皮细胞或细胞串计为 1 个微血管,血细胞和大的血管腔不计。1.5 统计学方法所有数据均用 xs 表示,采用 Microsoft excel 软件对数据做统计学处理,采用方差分析。2 结果(见表 1)表 1 半枝莲乙醇提取液与反应停对 H22 移植瘤的影响(略)注：与 D 组比较,*P0.0
14、5；与 C 组比较,P0.05,P0.01 3 讨论Caspases 是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteinyl aspartate-specific proteinase) 的简称,在细胞凋亡的信号通路中,Caspase-3,7 是处于核心地位的效应分子,其酶原能够被 Caspase-8 和 Caspase-9 激活,最终导致细胞凋亡。2006 年,Judy Yuet-Wa Chan等3研究发现,半枝莲中分离的脱镁叶绿甲酯酸(pheophorbidea,C35H36N4O5)可通过抑制 Bcl-2 基因,DNA 断裂,阻滞细胞周期,释放细胞色素 C 进入胞质和激活Caspases-3、Ca
15、spases-9 等机制诱导肝癌 Hep3B 凋亡。本实验采用半枝莲乙醇提取液瘤内注射联合反应停治疗 H22 移植瘤,联合用药组瘤重明显小于对照组(P0.01)。其具体的抗肿瘤作用机制值得进一步探讨。血管形成是肿瘤生长、转移、复发的关键环节,是瘤细胞诱导毛细血管形成而建立血液循环的过程。DAmato 等4进行家兔角膜微袋分析研究后,发现反应停能抑制由 bFGF 诱导的血管生成。Kenyon 等5在小鼠试验中证实,反应停能有效抑制由 bFGF 和 VEGF 诱导的角膜血管生成。适量的肿瘤坏死因子 (TNF-)是机体免疫防护的重要介质,而过量的 TNF- 可影响宿主的免疫状态,造成体重下降、恶5液
16、质、免疫应答改变和贫血等。在许多恶性肿瘤中,TNF- 表达过高。在反应停生物活性中,最确切的就是其对很多恶性肿瘤中过多表达的 TNF- 的抑制作用6。Rowland 等7通过 RT-PCR 研究证实了反应停诱导 TNF- 的 mRNA 的降解从而选择性的抑制了 TNF- 的表达。本研究采用小剂量反应停(50 mg/kg)联合半枝莲乙醇提取液瘤内注射治疗小鼠移植瘤,观察到反应停组和半枝莲乙醇提取液组均有抗肿瘤血管生成作用,且两药联合有协同作用。虽然反应停组瘤重小于对照组,差异无统计学意义,但是反应停和半枝莲联合用药对 H22 移植瘤有显著的抑制作用,其具体机制值得进一步研究。BALB/C 小鼠肝癌移植模型周期较短,肿瘤的大小和位置较易控制,与人肝癌有所不同。因此,已在移植瘤模型上取得的初步结果是否与人体一致还需进一步验证。【参考文献】1 李海燕,方肇勤,梁尚华.小鼠移植性肝癌(H22)模型的研究及在中医药抗
