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1、1口蹄疫病毒 VP1 基因真核表达载体的构 建及其在树突状细胞的表达作者：李杰, 王若, 石玮, 边海霞, 张丽, 张雷, 王家鑫【摘要】 目的: 构建口蹄疫病毒 VP1 基因的真核表达载体, 转染并筛选稳定表达VP1 的树突状细胞(dendritic cell, DC)。方法: 将 pMD 18 VP1 克隆于pcDNA3.1(+)中, 构建重组质粒, 酶切鉴定, DNA 测序证实序列正确后, 利用脂质体将重组质粒转染 DC, 经含 G418 培养基筛选获得抗 G418 细胞克隆, 用Western blot 鉴定 FMDV VP1 基因在 DC 中的表达。结果: 构建的pcDNA3.1 V
2、P1 真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及序列分析证实了其序列的正确性, SDS PAGE 和 Western blot 结果显示 G418 筛选获得 DC 稳定表达VP1。结论: 成功地构建了重组质粒 pcDNA3.1 VP1 真核表达载体, 并在 DC 中得到稳定表达。 【关键词】 口蹄疫病毒; VP1 基因; 真核表达; 细胞转染; 树突状细胞Abstract AIM: To construct the eukaryotic expression vectors for the FMDV VP1 gene and transfect dendritic cells(DC) for the
3、 expression of VP1. METHODS: The plasmid pMD 18 VP1 was subcloned into pcDNA3.1(+) to construct recombinant eukaryotic expression plasmids named as pcDNA3.1 VP1. The recombinant plasmids were transfected into DC by lipofectamine method and the positive cell clones were screened with G418. The expres
4、sion of FMDV VP1 gene in DC was determined by Western blot. RESULTS: The correct construction of pcDNA3.1 VP1 was identified by means of restriction enzyme analysis and nucleotide sequence determination. It was showed by SDS PAGE and Western blot that transfected cells, DC, expressed FMDV VP1 gene c
5、onstantly. CONCLUSION: The pcDNA3.1 VP1 eukaryotic expression plasmids are successfully constructed and VP1 gene can be sustainly expressed in DC.Keywordsfoot and mouth disease virus; VP1 gene; eukaryotic expression; cell 2transfection; dendritic cell口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)分为 O、 A、
6、 C、 Asia I、 SAT1、 SAT2 和 SAT3 等 7 个血清型。FMDV 衣壳由 4 种结构蛋白 VP1、 VP2、 VP3、 VP4 各 60 分子组成, 其中 VP1 为主要的抗原蛋白, 在已发现的 O 型 5 个抗原位点中有 3 个位于 VP1 上。在 VP1 第 140160 位氨基酸处有一个长的、 结构稳定的 G H 环, 环上的氨基酸构成能刺激免疫应答的 T、 B 细胞抗原表位, 是病毒表面的主要抗原位点, 在其顶部形成一个高度保守的 Arg Gly Asp(RGD)序列, 是 FMDV 与宿主细胞受体相结合的位点1, 2。VP1 是口蹄疫病毒中惟一能够产生中和抗体的
7、最重要的结构蛋白, 它以突起的形式暴露在病毒粒子的表面, 在免疫应答中发挥着主要作用3。因此, VP1 成为各类新型疫苗研究的主要抗原之一。DC 是目前已知的功能最强大的专职性抗原提呈细胞, 并能以交叉途径提呈非复制性抗原, 激活 CD8+T 细胞, 从而发挥对病原体的杀伤作用4。基因转染的 DC 可以激活 CD8+T 细胞产生 IFN 5, 并诱导 CD4+T 细胞产生更多的 Th1型细胞因子, 因此, 基于 DC 的基因工程研究已成为抗病毒免疫的一个热点问题6。有报道显示, DC 在机体抗 FMDV 感染免疫中发挥重要作用7, 但野毒感染可造成 DC 功能严重损伤。同时, 由于对 FMDV
8、 的灭活处理可直接改变病毒蛋白的抗原性质, 所以用灭活 FMDV 作为抗原来源研究 DC 提呈抗原的机制则不能反映机体的自然过程。因此, 将 FMDV 的 VP1 基因转染 DC, 使其表达 VP1 就成为研究 DC 提呈 FMDV 抗原机制的理想途径之一。本研究中, 我们构建了口蹄疫病毒 VP1 基因的真核表达质粒 pcDNA3.1 VP1, 利用脂质体转染 DC, 得到了稳定表达。1 材料和方法31.1 材料 O 型 FMDV 的 pMD 18 VP1 质粒由军事兽医学研究所金宁一教授惠赠, 大肠杆菌感受态细胞 DH5 和普通质粒小提试剂盒购自北京天根公司, 凝胶回收试剂盒、 T4 连接酶
9、、 EcoR I、 Hind III、 Sac I 限制性内切酶购自大连宝生物公司, D7500 和 D2000 为北京天根公司产品, LipofectamineTM 2000 Reagent 为 invitrogen 公司产品。G418 为 Solarbio 公司产品。仓鼠抗小鼠 CD11c购于 BioLegend 公司, 异硫氰酸荧光素标记(FITC)羊抗仓鼠 IgG 和 FITC 标记羊抗小鼠 IgG 购于 eBioscience 公司, FITC 标记羊抗兔 IgG 购 Santa Cruz 公司, 小鼠抗 MHC Class1 Ab 购于 Chemicon 公司, 硝酸纤维膜(NC
10、0.45 m)购于Scientific Research Special 公司。1.2 方法1.2.1 单核细胞源树突状细胞(MoDCs)的制备 无菌条件下, 用摘眼球法进行BALB/c 小鼠采血, 放入含肝素钠的离心管中, 摇匀。加入等量的 Hanks 液, 混匀。然后轻轻至于淋巴细胞分离液上, 使二者之间有一清晰界面, 室温下, 以 2 000 g离心 20 min。用滴管吸出中间薄层细胞, 用 Hanks 液悬浮细胞, 室温下, 以 1 500 g 离心 10 min, 洗涤 2 次。弃去上清液, 然后用 RPMI 1640 完全培养液将细胞悬液加入到培养瓶中, 置 37、 50 mL/
11、L CO2 培养箱中孵育 3 h 后弃上清液, 用37预热 RPMI 1640 完全培养液轻轻洗涤贴壁细胞 2 次, 去除非贴壁细胞, 即得贴壁单核细胞。在培养瓶中加入含 20 g/L rmGM CSF 和 20 g/L rmIL 4 的RPMI 1640 完全培养液中培养, 每隔两天半量换液 1 次, 补充新鲜培养液, 连续3 次。第 7 天, 弃去非贴壁细胞, 加入 5 mL, 5 mol/L EDTA/PBS 于培养皿中, 37孵育 20 min, 反复用力吹吸培养瓶中的培养基, 使贴壁细胞完全脱落, 室温下 1 500 g 离心 10 min, 吸去上清, 将沉淀重悬在适量的 RPMI
12、 1640 完全培养液中, 用 DMSO 配成 10%细胞悬液, 冻存于液氮中备用。41.2.2 MoDCs 的鉴定 将 MoDCs 分别用小鼠抗 MHC Class1-Ab 和仓鼠抗小鼠 CD11c 以及兔抗牛 S 100 多克隆抗体标记 MoDCs, 再依次加入 FITC 标记羊抗鼠 IgG, FITC 标记羊抗仓鼠 IgG 和 FITC 标记羊抗兔 IgG, 进行免疫荧光染色, 用流式细胞仪(FACS 420 型)对其进行表型分析鉴定。1.2.3 pcDNA3.1 VP1 重组质粒的构建 将 pMD 18 VP1 重组质粒和转座载体 pcDNA 3.1(+), 分别用 EcoR I 及
13、Hind III 进行酶切, 37 酶切 5 h, 用 TaKaRa凝胶纯化回收试剂盒的方法回收 VP1 基因片段及线性化 pcDNA 3.1(+), 用 T4 DNA 连接酶 16连接过夜, 构建重组转座质粒 pcDNA3.1 VP1, 转化大肠杆菌DH5, 挑取单菌落, 提取质粒经酶切鉴定, 并进行测序。1.2.4 G418 浓度梯度实验 复苏 MoDCs 进行计数, 用无血清 RPMI 1640 培养液调整细胞密度为 1106/L, 接种于 24 孔培养板中, 每孔加入 100 L 的细胞悬液及无双抗的培养基 900 L。每孔中添加 G418 浓度为 0、 100、 200、 300、
14、400、 500、 600、 700、 800、 900、 1 000、 1 100 mg/L 12 个等级, 每 3 d 换 1次液, 培养 14 d 记录细胞全部死亡的最低浓度。以最低浓度向上增加一个稀释度作为筛选浓度。1.2.5 质粒的线形化处理 pcDNA3.1 VP1 用 Sac I 酶切处理 5 h, 在紫外灯下回收目的片段, 称重, 用凝胶回收试剂盒回收, 纯化(线性化的质粒利于细胞的转染)。 1.2.6 转染 MoDCs 复苏 MoDCs 后 5 h 进行计数, 用无血清培养液调整细胞密度为 1.2109/L, 接种于 6 孔培养板中, 于 37、 50 mL/L CO2 的饱
15、和度湿度下培养, 待细胞生长至 70%80%覆盖率时进行转染。按照5LipofectamineTM2000 试剂盒操作说明书进行空质粒 pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1 VP1 的转染 MoDCs, 转染后 48 h 加入 G418 (浓度为 0.9 g/L)选择培养基加压筛选 14 d 后, 筛选得到阳性细胞克隆。扩增培养即为稳定表达口蹄疫VP1 基因的 MoDCs, 命名为 DC VP1 细胞。1.2.7 用重组质粒 pcDNA3.1 VP1 免疫动物制备血清 选用 3 只健康的成年实验鼠, 第 1 次用普鲁卡因预处理后, 肌肉注射 pcDNA3.1 VP1 质粒 DNA, 每只1
16、00 g, 14 d 后进行第 2 次肌肉注射, 每只注射 100 g, 1 月后, 进行第 3 次肌肉注射, 每只 100 g, 1 月后从实验鼠的眼静脉采血, 制备血清。1.2.8 阳性细胞克隆的 Western blot 检测 收集转染细胞, 用裂解缓冲液裂解后取 20 g 处理后的蛋白样品进行 SDS PAGE, 取出凝胶至于硝酸纤维膜(0.45 m)上,用 Bio Rad 公司的蛋白质转印系统在转移缓冲液中, 电泳转印(20 V, 30 min), 用 50 g/L 脱脂奶粉室温封闭 1 h(封闭非特异性结合), 用上述免疫血清作为一抗(150), 室温 2 h, 4过夜, 第 2 天取出 NC 膜, 室温孵育 1 h, 用 TBST 洗膜 310 min, 以羊抗小鼠 lgG HRP(1300)作为二抗室温 2 h, TBST 洗 310 min, DAB 显色, 观察特异性条带。2 结果2.1 小鼠 MoDCs 的鉴定 从小鼠外周血中分离出的单核细
