《利凡诺对不同胚层来源细胞增殖能力的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《利凡诺对不同胚层来源细胞增殖能力的影响（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1利凡诺对不同胚层来源细胞增殖能力的 影响【摘要】 目的:观察利凡诺对来源于不同胚层的细胞生长和增殖能力的影响。方法:运用形态学观察法观察细胞在经不同浓度利凡诺(3.13、6.25、12.5 gml-1)作用不同时间(24、48、72 h)后形态学的改变，同时在荧光显微镜下观察细胞中利凡诺的荧光强度。用噻唑蓝(MTT)法以及核仁组织区银染法(AgNOR)检测利凡诺作用后各细胞增殖能力的改变。结果：利凡诺作用 24 h 后，肝细胞(BRL 3A)及成纤维细胞(L929)的形态无明显变化，人脐静脉内皮细胞(HuVEC)突起变细甚至消失，细胞生长速度变慢;伴随药物浓度的增大，单位面积细胞数逐渐减少;
2、3 种细胞内利凡诺自发荧光随着药物浓度增大和时间延长而增强。MTT 结果显示利凡诺对 3 种细胞的增殖都有一定的抑制作用，其中对 HuVEC 细胞增值能力的抑制强于另外两种细胞(均 P0.01)。在不同浓度利凡诺作用下，HuVEC 核仁组织区减少幅度较另外两种细胞更加明显，差异有统计学意义(P0.05 或 P0.01)。结论:利凡诺对来源不同胚层的 3 种细胞的增殖能力均有抑制作用，其中对 HuVEC 的抑制尤其显著，提示该药对内皮细胞生长增殖的抑制较为特异。 【关键词】 利凡诺; 人脐静脉内皮细胞; 肝细胞; 成纤维细胞Abstract Objective: To observe the i
3、nfluence of rivanol on growth and proliferation of cells form different germ layers. Methods: After treated by different rivanol concentration(3.13,6.25,12.5 gml-1) and different work time(24、48、72 h), morphological changes of cells and rivanol autofluorescence intensity in cells were observed under
4、 the fluorescence microscope. With methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method and silver staining nucleolar organizer region(AgNOR) method, the change of cell proliferation ability was detected. Results: After 24 h drug treating, the liver cells(BRL 3A) and fibroblasts(L929) had no significant morphol
5、ogical changes,while in human umbilical vein endothelial cells(HuVEC) protruding thinner or even 2disappear, cell growth slowed down. With the increase of rivanol concentration, cell numbers per unit area gradually reduced. Rivanol autofluorescence strength in three kinds of cells were dose time dep
6、endent increased. MTT results showed that rivanol had a certain degree of inhibition on three cell proliferation, and the inhibition to HuVEC was stronger than the other two cells(P0.01). After treated with different concentration of rivanol, the reduction of endothelial nucleolar organizing region
7、more pronounced than the other two kinds of cells and the difference was statistically significant(P0.05 or P0.01). Conclusion: The inhibition ability of rivanol to the proliferation of cells from different sources of the three germ layers was different.Among the three kinds of cells the inhibition
8、to HuVEC cells is particularly notable, suggesting that the rivanol on the inhibition of endothelial cell growth and proliferation is more sensitive.Key words rivanol; human umbilical vein edothelial cell; liver cell; fibroblast利凡诺(rivanol)由于在终止中期妊娠方面具有良好作用，自 1922 年被发现以来即受到了广泛关注和研究1-6，而对利凡诺在其他领域的作用研
9、究较少。20 世纪 90 年代，本研究组首先报道了利凡诺的抗肿瘤作用7-9，此后又发现利凡诺对人脐静脉内皮细胞(HuVEC)也具有较强的抑制作用9，所以我们推测利凡诺对血管内皮细胞的抑制是其抗肿瘤机制之一，亦即利凡诺可能是一种潜在的血管生成抑制剂。但是目前许多血管生成抑制剂对机体的正常细胞也有较强的毒副作用，不利于长期用药，从而使其抗肿瘤作用的发挥受到很大限制。显然有必要了解利凡诺抗肿瘤作用是泛细胞毒效应，还是对某类细胞有特异的抑制作用。基于此，本实验选择来源于内胚层的正常肝细胞(BRL 3A)，来源于中胚层的 HuVEC 和成纤维细胞(L929)作为实验基础材料，观察不同浓度利凡诺对不同胚层
10、来源细胞的增殖能力的影响是否存在差异性，进一步探讨利凡诺抑制细胞生长的机制及其临床应用的可能性。1 材料和方法1.1 材料31.1.1 细胞培养及处理 HuVEC、L929 细胞株系本实验室张东生教授惠赠(购自中国科学院上海细胞生物研究所),将其接种于含 10%小牛血清和 100 Uml-1 青霉素、100 mgml-1 链霉素的 RPMI 1640 培养液中,置于 37 、体积分数为 0.05的 CO2 恒温培养箱中培养,每隔 23 d 传代 1 次。BRL 3A 细胞株系本实验组留存(购自中国科学院上海细胞生物研究所)，接种于含 10%小牛血清和 100 Uml-1青霉素、100 mgml
11、-1 链霉素的 DMEM 培养液中，培养方法同上。实验时选取对数生长期的细胞,用 0.25%胰酶和 0.02% EDTA 混合消化液消化制成单细胞悬液。1.1.2 利凡诺的配制及细胞分组 每次实验加药前取利凡诺注射液25 mgml-1,江苏天禾制药有限公司,批号 0306041,用含 5%小牛血清的 RPMI 1640 培养液(BRL 3A 用 DMEM 培养液)将其稀释至浓度分别为 3.13、6.25、12.5 gml-1(按体积比为 18 000、14 000、12 000 稀释)后立刻使用。细胞分组：(1) 实验组,按利凡诺的浓度分为 3.13、6.25、12.5 gml-1 共 3 组
12、;(2) 对照组,加入与实验组等体积的 RPMI 1640 培养液(BRL 3A 用 DMEM 培养液)。1.2 方法1.2.1 细胞生长的形态学观察 选取对数生长期的细胞制成单细胞悬液,用RPMI 1640 培养液稀释,细胞浓度为 6104 ml-1,置于饱和湿度、37 、体积分数为 0.05 的 CO2 恒温培养箱中培养,贴壁并生长状态良好后按照实验组与对照组进行药物处理。加药后于 24、48 和 72 h 用相差显微镜观察细胞形态，用荧光显微镜观察细胞内利凡诺的荧光分布及强度。1.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测细胞生长抑制率 选取对数生长期的细胞调节细胞浓度为 6104ml-1,接种于
13、96 孔培养板内,待细胞贴壁并生长状态良好后按照对照4组与实验组进行药物处理,药物处理后在同样条件下培养 24、48 和 72 h 后每孔加入 20 l MTT(质量浓度为 5 gL-1，用 0.01 molL-1 的 PBS 配制)继续培养 4 h,弃去孔内液体,每孔加入 150 l 二甲基亚砜(DMSO),振荡 10 min,在酶标仪(Multiskan MK3O353)492 nm 处测定吸光度值(A),每组设 6 个平行孔,取平均值,按以下公式计算细胞生长抑制率(P):P=(对照孔 A492-实验孔 A492)/对照孔 A492100%1.2.3 核仁组织区银染法(AgNOR)检测细胞
14、增殖能力 选取对数生长期细胞，调节浓度为 1.5105 ml-1 接种于 6 孔板内，板内放入经过处理的细胞爬片，待细胞贴壁生长良好、细胞面积至爬片总面积的 50%70%时，按照实验组与对照组进行药物处理,药物处理后在同样条件下培养 24、48 和 72 h 后，取出爬片用冷丙酮固定，滴加 AgNOR 染色液室温暗处放置 30 min，双蒸水洗涤 30 min，在高倍(400)显微镜下随机选取 5 个视野，计数 100 个细胞内平均阳性颗粒数，根据颗粒数量、形态、大小等变化判断细胞的增值状态。每种细胞每个时间点均设有空白对照，按以下公式计算细胞核仁组织区减少率(P)：P=(对照组的阳性颗粒数-
15、实验组阳性颗粒数)/对照组阳性颗粒数100%1.3 统计学处理数据用 x-s 表示，采用 SPSS 11.5 软件进行统计学分析，组间比较采用方差分析，P0.05 为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 利凡诺对 BRL 3A、L929、HuVEC 细胞形态学的影响 正常状况下BRL 3A 细胞在倒置相差显微镜下细胞形态呈椭圆形或圆形,呈巢状或漩涡状排5列;细胞大小均一,胞浆丰富,胞核较小呈梭形或椭圆形,位于细胞中央;经利凡诺处理后 BRL 3A 形态无明显改变。正常状态下 L929 细胞体积较肝细胞大，呈长梭形或长椭圆形,条索状或成团生长，胞浆丰富，核圆形位于细胞中央;利凡诺作用后，细胞形态
16、变化不明显，有少量细胞变小变圆变亮甚至漂浮。正常情况下 HuVEC呈多角多边形，体积较大，成团或呈铺路石样生长，边缘细胞伸出突起，核小圆形位于细胞中央;利凡诺处理后细胞形态变化较其他两种细胞明显，突起变细变多，但是生长速度变慢，可见大量细胞变小变圆变亮甚至漂浮于培养液中。药物自发荧光主要位于细胞核，而且在 L929 和 HuVEC 两个细胞系荧光较强。这种现象随药物浓度的增大和药物作用时间的延长而明显(图 1)。 2.2 MTT 法检测利凡诺对 BRL 3A、HuVEC、L929 细胞生长的影响 MTT 法检测显示,3 种浓度的利凡诺在 72 h 内对 BRL 3A、L929、HuVEC 细胞都有抑制作用,对 HuVEC 细胞的抑制作用更加明显，L929 细胞次之，对 HuVEC 的抑制作用与同时段 BRL 3A、L929相比差异均有统计学意义(均 P0.01,图 2);就 HuVEC 细胞而言，相同作用时间，不同浓度组间抑制作用均有显著性差异(均 P0.05,
