《人红细胞20S蛋白酶体的蛋白质组学表征及不同来源20S蛋白酶体异质性的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人红细胞20S蛋白酶体的蛋白质组学表征及不同来源20S蛋白酶体异质性的研究（7页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1人红细胞 20S 蛋白酶体的蛋白质组学表 征及不同来源 20S 蛋白酶体异质性的研 究作者：陈国强 刘辉 张海婧 邓艳春 李智立【摘要】 通过整合差速离心和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE)技术，建立了能有效分离 20S 蛋白酶体（20S core particle，CP）的方法。与传统纯化方法比较，此方法具有经济、快速的特点，并且能够对不同组织细胞来源的 CP 进行分离。利用本方法对人红细胞来源的 CP 亚基进行了 2 DE 分离和 MALDI TOF/TOF MS 鉴定。结果显示，可鉴定出 33 个具有不同相对分子量和等电点的蛋白点，此数量远远多于 CP 亚基的 14 种
2、。此外，利用非变性/变性十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（native/SDS PAGE）技术，比较了来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、人胰腺癌细胞系 SW1990 和 PANC 1 的 CP 及其亚基在电泳行为方面的差异，进行了蛋白酶体异质性初探。 【关键词】 蛋白酶体，异质性，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，差速离心，细胞系1 引言20S 蛋白酶体（20S core particle，CP）以不同的方式与其它蛋白酶体相关激活因子，如 19S 调节颗粒、11S 调节颗粒（又称 PA28）和 PA200 结合（未经特别说明，以下所称“蛋白酶体”包括 CP 以及 CP 与上述不同激活因子结合后形成的复
3、合体），介导胞内蛋白降解并参与细胞周期调控、DNA 修复、染色体稳定、转录激活、信号转导和抗原提呈等过程13。CP 是一个相对分子量约为 700 kDa 的蛋白质复2合体，由 14 种亚基组成，分别称为 17，17，并共同形成一个桶状结构7777。传统的生化分离方法和基于抗体的免疫亲合层析技术目前仍然是 CP 分离的主要技术手段。前者作为经典的分离纯化方法，一般涉及选择性硫酸铵沉淀、甘油密度梯度离心以及液相色谱等步骤4,5，操作繁琐耗时。免疫亲合层析技术由于其操作简便，并可在数小时内完成，正越来越多地被应用于 CP 分离6,7。然而，免疫亲合层析技术涉及的抗体一般价格较贵，而且对不同物种来源的
4、 CP 需要使用不同的抗体，限制了对某些物种来源的 CP 的研究。本研究采用了差速离心结合非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（native PAGE）的方法对人红细胞内源性 CP 进行分离，然后利用蛋白质组学技术对 CP 各个亚基进行分离和鉴定；此外，利用非变性/变性十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳（native/SDS PAGE）技术对来源于酵母、小鼠肝脏、人红细胞、人胰腺癌细胞系 SW1990 和 PANC 1 的 5 种 CP进行了蛋白酶体异质性研究。2 实验部分2.1 仪器、试剂和材料QSTAR XL 四极杆 飞行时间串联质谱仪（美国 Applied Biosystems 公司），配有电喷雾离
5、子源（ESI）及 Analyst QS 1.1 数据处理系统；XTremeSimple Nano Ultra高效液相色谱系统（美国 Micro Tech Scientific 公司），与 QSTAR XL 四极杆 飞行时间串联质谱仪联用；Autoflex III 基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱仪（MALDI TOF/TOF MS，德国 Bruker Daltonics 公司），配有 MTP AnchorChip 样品靶和 BioTool 3.1 蛋白搜库软件（含 Mascot 蛋白搜索引擎的链接：3http:/ DE）系统（美国 GE Healthcare公司），包括 Ettan IP
6、Gphor III 等电聚焦仪及 DALTsix 垂直电泳设备；超速离心机Optima XL 80 （美国 Beckman Coulter 公司），配有 SW 50.1 离心转子。乙腈、甲酸和三氟乙酸（色谱纯，美国 Thermo Fisher 公司）； 氰基 4 羟基肉桂酸（CHCA）、牛甲状腺球蛋白（相对分子量约为 670 kDa，作为 native PAGE 的相对分子量指示标准品）、酸洗玻璃珠（425600 m）和 AgNO3(Sigma Aldrich公司)；红细胞蛋白酶体标准品（含 CP 和 26S 蛋白酶体，美国 Biomol 公司）；测序级胰蛋白酶（罗氏公司）；二维凝胶电泳所需试
7、剂和等电聚焦胶条 IPG DryStrip（24 cm，pH 310，非线性，美国 GE Healthcare 公司）。在常规 YPD 培养基（含 1%酵母提取物，2%蛋白胨和 2%葡萄糖）中培养的CG1945 酿酒酵母；2 月龄 SPF 级 C57BL/6J 小鼠的肝脏；人红细胞（北京市红十字会血液中心）；在含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 培养基中培养的人胰腺癌细胞系SW1990；在含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基中培养的人胰腺癌细胞系PANC 1。2.2 实验方法2.2.1 差速离心 在 2 g 酵母、2 g 小鼠肝脏（已碾碎）、2 mL 红细胞、2 g SW1990 和
8、2 g PANC 1 细胞中，分别加入 4 mL 裂解液（40 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷 盐酸（Tris HCl）， pH 7.5）, 5 mmol/L MgCl2, 0.5 mol/L NaCl, 1 mmol/L二硫苏糖醇（DTT）, 1 mmol/L 苯甲基磺酰氟（PMSF）, 10 mmol/L NaF 和 10 mmol/L Na4P2O7），4 放置 1 h（在酵母裂解液中加入酸洗玻璃珠进行机械振荡破碎），然后进行差速离心：115000g，150 min，吸取上清；再对此上清液进行离心，4243000g，240 min，小心倒去上清液，用 300 L 溶液（20 mmol/L
9、 Tris HCl（pH 7.5）, 5 mmol/L MgCl2, 100 mmol/L NaCl, 1 mmol/L DTT）将沉淀重悬后，离心去除不溶物，此上清液即为部分纯化的含 CP 的蛋白质混合物样本（crude CP，cCP）。2.2.2 Native PAGE、native/SDS PAGE 和 2 DE native PAGE 按照文献8的方法进行。native/SDS PAGE 的操作步骤：将经过 native PAGE 后含 CP 的蛋白条带切下，用乙腈完全脱水后，加入 50 L 溶液（250 mmol/L Tris Cl（pH 6.8），20%甘油，2% SDS，40 m
10、mol/L DTT 和痕量溴酚蓝）。再加入 300 L 水，静止 60 min，吸取上清液，此步骤重复 2 次。将合并后的上清液真空抽干至一定体积（约50 L）后，进行 12.5% SDS PAGE 分离。2 DE 的操作步骤：CP 条带经脱色（50%乙腈和 25 mmol/L NH4HCO3）和乙腈脱水后，加入 550 L 溶液（7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，2% 3 3 (胆酰胺丙基)二甲氨基丙磺酸内盐（CHAPS），1.2% DestreakTM 试剂和 0.5% IPG Buffer（pH 310, 非线性），将条带用镊子充分碾碎后再进行第一维等电聚焦电泳分离，之后进行第
11、二维 12.5% SDS PAGE 分离。2.2.3 蛋白酶切 切下经 native PAGE 分离后的 CP 银染条带，用 15 mmol/L K4Fe(CN)6 和 50 mmol/L Na2S2O3 溶液将其脱色后，再进行胰蛋白酶酶切9，并将此酶切上清液进行 LC MS/MS 鉴定。切下 2 DE 胶上蛋白点，按照文献9的方法进行脱色和酶切。2.2.4 液相色谱 串联质谱分析（LC MS/MS） Micro Tech Scientific MN 15 C18WSS 75 EU 反相色谱柱（15 cm75 m， 3 m）；流动相 A：2%乙腈和 0.1%甲酸水溶液；流动相 B：100%乙腈
12、和 0.1%甲酸溶液；洗脱条件：060 min，5%20% B；6090 min，20%30% B；90120 min，30%90% B；流速：0.3 L/min；QSTAR XL 四极杆 飞行时间串联质谱仪 ESI 喷雾电压：2.6 kV；扫描5范围： m/z 4001500；数据依赖性扫描模式（information dependent acquisition model），即进行 1 个全扫描后，选择 3 个信号强度最高的肽段离子进行 MS/MS 扫描。2.2.5 基质辅助激光解吸/电离飞行时间串联质谱（MALDI TOF/TOF MS） 取胰蛋白酶酶切后上清液 1 L，点样于 MTP
13、AnchorChip 靶上，室温自然干燥后，加上 1 L 0.67 g/L CHCA（用含 70%乙腈和 0.1%三氟乙酸的溶液配制），待完全干燥后进行 MALDI TOF/TOF MS 鉴定。3 结果与讨论3.1 CP 的分离为了证明整合差速离心和 native PAGE 能有效分离 CP，本研究直接对经差速离心后得到的红细胞 cCP 进行了 native PAGE 分离，并用 AgNO3 染色。如图1A 所示，cCP 经 5.5% native PAGE 电泳 1 kVh 后，在泳道 cCP 中观察到一条带的电泳迁移距离与蛋白酶体标准品中的 CP（泳道 M）相近。为了证明泳道 cCP 中的
14、蛋白条带为含 CP 条带，切下该条带，并进行胶内胰蛋白酶酶切和 LC MS/MS鉴定。结果显示，亚基 2 序列中的 GYSFSLTTFSPSGK, LVQIEYALAAVAGGAPSVGIK, KLAQQYYLVYQEPIPTAQ LVQR 和 LAQQYYLVYQEPIPTAQLVQR，3 序列中的 HVGMAVAGLLADAR，SLADIAR 和 EEASNFR 以及 4 序列中的LAAERRNIHK 得到了 LC MS/MS 鉴定，其中 GYSFSLTTFSPSGK 的 MS/MS 图谱如图 1B 所示，表明此质谱鉴定结果是可靠的。以上结果表明，通过整合差速离心和 native PAGE
15、 能对 CP 进行有效的分离。图 1 人红细胞 CP 的分离以及 LC MS/MS 鉴定（略）6Fig.1 Isolation and mass spectrometric identification of human erythrocyte 20 core particle(CP)(A) CP 经 5.5% native PAGE 后得到分离（5.5% ative PAGE isolation for CP）; (B) 2 亚基序列 GYSFSLTTFSPSGK 的 MS/MS 图谱（MS/MS spectrum of GYSFSLTTFSPSGK of subunit 2）。 3.2 C
16、P 亚基的蛋白质组学表征为了证明利用本分离方法得到的 CP 是由 14 种亚基组成的完整复合体（7777），以及为了能够利用蛋白质组学技术在亚基水平上研究蛋白酶体异质性（roteasome heterogeneity），将来自 native PAGE 上的 CP 进行了 2 DE 分离，并将分离得到的亚基进行胰蛋白酶酶切和 MALDI MS/MS 鉴定。表 1 为每个蛋白点的质谱鉴定结果，除包含肽质量指纹图谱（eptide mass fingerprinting，PMF）信息外，还至少有一个肽段得到 MS/MS 鉴定。如图 2 和表 1 所示，经 2 DE 分离和质谱鉴定后，33 个具有不同相对分子量和等电点（p）的蛋白点得到了鉴定，此数量远多于 CP 亚基的 14 种，表明其中大部分亚基存在着不同的亚型（soform）。如图 2 所示，除 5， 5 和 6 外，其余亚基都
